胰腺癌生物模型的應用現狀與展望*

徐 冬 楊 飛

(南京市高淳人民醫院 1.普外科,2.大內科,南京 211300)

胰腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)將在2030年躍居全球癌癥發病率第二位,其發病隱匿、易早期轉移的特點使患者在就診時常處于中晚病期而失去根治性手術機會,雖然包括FOLFIRINOX等方案在內的綜合治療使PDAC患者的5年生存率由6%升至10%,但整體預后仍然很差[1-2],研究其發生發展的分子機制對PDAC診療具有重要意義。PDAC的生物學特點使臨床醫生很難在根治性手術前提下、完整獲取不同分期的病灶以驗證通過各種組學方法篩選的某些新靶點的生物學功能。因此,亟需一種可同時助力PDAC發生發展、轉移、復發等機制研究,并用以探索新治療手段的生物模型。理想的PDAC模型需具備以下特點[3]:(1)具有與人源PDAC相似的生物發展過程且穩定可重復。(2)具備諸如免疫逃逸、侵襲、轉移、神經侵犯等惡性表型。(3)模型構建效率高、成本低、周期短、可量產。而目前用于PDAC研究的諸如自發誘導模型、移植瘤模型、類器官模型以及大動物模型,雖然可重現PDAC的某些病理過程,但仍不能完整模擬PDAC的生物學變化,優勢與弊端并存[3]。本文綜述了上述各類生物模型的應用現狀,以期為PDAC研究的模型選擇提供參考。

1 誘導模型

誘導模型,指使用化學或基因技術誘導實驗動物產生類似人源結構的特定腫瘤,且該腫瘤的研究結果與人源腫瘤高度類似。由于構建該模型監測時間長、花費高、成功率不一,且無法在短期內獲得大量的腫瘤組織,限制了其應用。

1.1 化學誘導

Wilson等[4]于1941年首次發現,白化大鼠在長期食用添加2-乙酰胺氟的食物后出現胰腺癌,組織學呈現腺瘤及腺泡細胞癌,而無導管樣結構。在1974年由Pour等成功構建首個類似人PDAC的嚙齒類動物誘導模型,即連續接受含2,2’-二羥基-二-N-丙基亞硝胺(DIPN)喂食的敘利亞金黃倉鼠出現可侵犯神經并具有肝、肺、淋巴結轉移傾向的胰腺癌,同時出現諸如體質量減輕、黃疸、腹水和血栓形成等癥狀,另外還合并第12密碼子的KRAS點突變(G12D)以及抑癌基因CDKN2A的缺失和異常甲基化,但無抑癌基因Trp53突變[5]。亦有研究報道,N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺(BOP)特異性誘發倉鼠胰腺癌但機制不明,而對豚鼠、兔子等動物無致瘤作用,BOP模型除了具有DIPN模型的特征之外,還可檢測到糖耐量異常以及CA125、EGFR等血清抗原的異常表達[6-7],組織分析發現BOP誘導的倉鼠胰腺導管損傷起源于異常增殖的導管細胞,而不是去分化的腺泡細胞[8]。目前,已有包括重氮絲氨酸、氯貝特等在內的16種化合物可以誘導鼠類胰腺癌發生,同時還發現在使用不同類型化合物誘導后,鼠類主要發生無導管結構的胰腺腺泡型腫瘤,而對豚鼠化學誘導的胰腺癌組織分析顯示,PDAC主要經由腺泡-導管化生(acinar-to-ductal metaplasia, ADM)的病理生理學過程發展而來[9]。化學誘導的倉鼠模型,可以幫助識別已知的和新出現的人PDAC危險因素并指導針對性干預措施的實施,但致癌化合物特異性差,在誘導PDAC的同時也可能誘發其他腹腔器官腫瘤,限制了其應用。

1.2 基因工程誘導

正常胰腺上皮發生癌變與癌基因KRASG12D的激活,及其與抑癌基因CDKN2A、Trp53、Smad4、BRCA2等失活之間的協同作用密切相關。有研究于2003年利用彈性蛋白酶啟動子介導,首次成功構建并證實單獨的KRASG12D突變可誘導正常胰腺導管發生非侵襲性癌前病變,即上皮內瘤變(PanINs),但不會導致侵襲性癌變的小鼠模型[10]。后經Brembeck FH通過細胞角蛋白19(CK19)報告基因實驗證實KRASG12D突變誘導的胰腺導管樣病變可能通過ADM發生并伴隨病灶周圍淋巴細胞浸潤,靶向抑制KRASG12D表達后小鼠未出現PanINs[10]。基于KRASG12D在PDAC發生中發揮的驅動作用,結合條件基因打靶技術(即Cre-Loxp技術)經靶向胰腺的組織特異性啟動子介導將癌基因導入小鼠胚胎或體細胞后誘發胰腺癌,即為基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse models, GEMMs)[11],常見種類包括[10,12-15]:①KC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre)模型:致瘤緩慢,可出現正常胰腺組織-ADM-PanINs的病理過程,具備發展為PDAC傾向,主要用于胰腺癌早期發生和預防方面的研究。②KPC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,LSL-Trp53R172H或CDKN2Alox/lox)模型:致瘤迅速,可出現正常胰腺組織-PDAC-侵襲轉移的病理過程,被周圍基質包繞的瘤體血供豐富且對吉西他濱耐藥,主要用于PDAC發生發展、轉移、耐藥等方面的研究,目前被認為是研究PDAC發生發展分子機制的動物模型金標準。③KIC(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,CDKN2A/Arflox/lox)模型:亦可出現正常胰腺組織-PanINs-PDAC-侵襲轉移的病理過程,但腫瘤進展比KPC模型更快,用途同KPC模型。④KD(LSL-KRASG12D,Pdx1-Cre,Smad4lox/lox)模型:可緩慢形成胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN),用以研究IPMN發生發展及逐步癌變的分子機制。⑤其他模型:比如PRF1a-Cre,LSL-KRASG12D,TGFBR2lox/lox模型的瘤體組織結構類似人PDAC,用以研究轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路對PDAC發展的作用機制,Nestin-Cre,LSL-KRASG12D模型,由于腫瘤侵犯神經,該模型小鼠生存期較短,用以研究胰腺炎加速PDAC發生發展的分子機制。

另外,亦有非依賴KRASG12D突變的GEMMs報道。有研究利用大鼠彈性蛋白-1啟動子介導、在小鼠體內表達致癌猿猴病毒40T抗原后出現胰腺腺泡發育不良,成年后發展為腫瘤,生存期約為4至6個月[16]。還有研究基于抑癌基因PTEN失活構建的Pdx1-CreERTM; PTENlox/lox模型在3周齡時出現ADM,并在11周齡時出現PDAC[17]。

GEMMs雖可模擬人源PDAC發生發展、侵襲轉移、耐藥等病理過程,并確定治療效果,但也有其弊端:①建模時間不可控、成本高、難以量產。②難以鑒定GEMMs與人源PDAC的同源程度,不能完全理想化詮釋PDAC的發生發展機制。③在建模過程中,可能會引入新的未知突變。

2 移植瘤模型

移植瘤模型是指將PDAC細胞系或人源PDAC原代細胞、組織接種于免疫缺陷鼠(裸鼠或SCID鼠)體內所形成的荷瘤動物模型。按接種部位分為原位移植、異位移植;按移植物來源分為同種移植和異種移植,后者根據移植物種類分為人源腫瘤細胞移植模型和人源腫瘤組織移植模型(patient-derived tumor xenografts, PDX)[18]。

有研究于1963年構建了首例胰腺癌細胞系[19],在使用PDAC細胞系構建原位/異位模型之前,需充分了解擬選擇的細胞系的臨床背景,生長特性,黏附、侵襲、轉移等表型特征以及基因突變類型[3],比如:①在遷移能力方面,細胞系PANC-1是BxPc-3的5倍。②在成瘤能力方面,由強到弱的細胞系為Mia PaCa-2>Capan-1>PANC-1。③在轉移傾向方面,細胞系CFPAC-1、Capan-1易肝轉移,SW1990易脾轉移,Colo357、Hs766T易淋巴轉移,Capan-1/2易神經侵犯。隨著不同PDAC細胞系廣泛用于建立移植瘤模型,研究者發現其優勢包括易獲取、增殖周期短、可重復性高、成瘤迅速,同時發現隨著傳代次數增加出現的遺傳漂變,移植瘤周圍缺少典型的人源腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)以及無法代表人源PDAC的初期狀態和病變特征亦是其弊端[20]。

2.1 異位移植模型

異位移植是指將體外培養的PDAC細胞系或人源PDAC原代細胞接種于免疫缺陷鼠的腹背或腹股溝皮下(subcutaneous, SC)產生的移植瘤模型,具有操作方便、高效、可重復性高,并可直觀的監測移植瘤的生長情況的優勢,但該移植瘤僅限于皮下生長,無遠處轉移及內臟器官侵犯能力,無法真實反映PDAC的腫瘤微環境,因此僅用以評估腫瘤對抗體或細胞藥物等特定藥物的反應情況,尚不適合分子機制研究[21-22]。PDAC細胞懸液的異位移植還能構建轉移性模型用以研究PDAC的轉移機制[3],比如:①脾靜脈或肝包膜下注射構建肝轉移模型。②尾靜脈注射構建肺轉移模型。③鼠爪注射構建淋巴轉移模型。④將人體腹腔干或腸系膜上動脈表面神經組織移植在皮下,4周后在緊貼移植部位皮下注射癌細胞懸液的方法構建神經侵犯模型。

2.2 原位移植模型

又名同位移植(orthotopic transplantation, OT),是指將體外培養的PDAC細胞接種于裸鼠胰腺后成瘤,自1980年開始被廣泛應用,目前常用的接種方式包括[3]:①裸鼠胰腺包膜下注射細胞懸液,但可能因注射部位癌細胞滲漏導致腹腔種植轉移。②裸鼠皮下注射PDAC細胞懸液培養4周成瘤后,切除瘤體切割成1～2 mm3組織塊再接種于裸鼠胰尾包膜下。③將PDAC細胞懸液注射入熱敏生物凝膠,待其成瘤后再接種于裸鼠胰尾包膜下,膠體的黏附特性可防止癌細胞脫落。與SC模型相比,OT模型移植瘤的TME類似人源PDAC,并且瘤體在裸鼠體內自然生長,據此可進行生存率的模型研究[23]。但構建OT模型需嚴格的無菌操作和精細的外科切開縫合技術,術后也可能因切口感染、裂開,縫合胰腺胞膜所用縫線引起的局部炎性反應等并發癥導致建模失敗[24]。

2.3 PDX移植模型

是指將人源PDAC組織植入免疫缺陷鼠的胰腺,保留的人源TME能在移植初始(10代以內)模擬人體內的藥物傳遞狀態,并真實反應人源PDAC的組織學和遺傳學特征,鑒于能在普通SPF級動物實驗室制備的優勢,被應用于PDAC臨床前研究[25]。在PDAC腫瘤標志物鑒定方面,有研究于2006年首次利用PDX模型發現高表達脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, DCK)的PDCA對吉西他濱(gemcitabine, GEM)化療敏感性較高,后續還發現低表達Smad4且PDX建模成功的PDAC原宿主(患者)的生存期較短[26-27]。有研究通過放射性標記發現,丙酮酸向乳酸轉化增加的PDAC增殖較快[28]。在臨床前藥物評估方面,還有研究首次利用PDX模型發現與GEM單藥化療相比,球狀激酶1(Polo-like kinase 1, PLK-1)抑制劑利戈塞替布與GEM的聯合用藥可降低PDAC對GEM的耐藥性并進一步促進PDAC退縮,說明利戈塞替布可作為潛在的GEM增敏劑[29]。研究發現,PLK-4抑制劑CFI-400945能降低PDAC增殖標志物Ki-67的表達,抑制增殖并延長PDX模型的生存時間[30],說明CFI-400945具有潛在應用價值。在精準醫學和臨床相關性研究方面,研究表明入組了包括4例PDAC在內的14例實體腫瘤患者,利用63種具有抗癌活性的化合物、搭配成232種組合后給藥于構建的14例PDX模型,除了1例患者在研究結果明確前死亡之外,其余13例患者均接受了PDX模型預測的最有效的藥物治療,其中有11例患者接受了17種藥物組合后發現15種組合可出現腫瘤負荷持續緩解;而且針對PDAC患者,篩選了15種單藥和7種組合藥用于后續的臨床實驗[31]。有研究在一例已確診對GEM耐藥患者的PDX模型中發現腫瘤對絲裂霉素C和順鉑敏感,給予該患者絲裂霉素C單藥治療后其無進展生存期(progression-free survival, PFS)達到22個月,由于腎毒性影響,將絲裂霉素C更換為順鉑后,患者PFS又延長了36個月[32]。以上兩項代表性研究說明,PDX模型可助力腫瘤精準治療的發展。

另外,PDX模型亦有其弊端[33-34]:①該模型是已確定的人源PDAC衍生物,不適合研究在正常組織穩態和疾病起始中的基因突變和分子機制。②該模型建立在免疫缺陷鼠體內,不能反應人源免疫系統對PDAC發生發展的影響。③隨著PDX傳代次數增加,PDAC組織可能會出現遺傳漂變,導致無法與人源PDAC基因組同質化分析,并且移植的PDAC組織內的人源TME逐漸被宿主TME取代,無法反應人源TME對PDAC進展的影響。④人-鼠之間的分子受體、配體不相容,致使移植的PDAC組織在宿主體內無法重現其在人體內的某些分子生物學過程。⑤成瘤緩慢且移植成功率高低不一。

3 類器官模型

體外培養胰腺器官可追溯至1938年,有研究通過沖淋法體外培養鼠源胰腺組織達4周[35]。自1980年開始,探索如何體外培養3D結構胰腺組織的研究者漸多[36],其中利用瓊脂糖培養基將切取的人源PDAC組織在體外培養長達6 d并用于評估基因治療效果開啟了PDAC類器官研究的浪潮[37]。直至2015年,有研究首次利用基質膠成功構建了人源PDAC細胞的類器官(patient-derived organoids, PDO),并將其原位移植于免疫缺陷鼠體內,產生類似癌前病變并進展為侵襲性癌變伴轉移的效果[38]。目前,PDO是指將手術切除的PDAC標本或活檢組織,在細胞類型、基質膠、生長因子及信號傳導四方面條件均具備情況下,培養出的保留PDAC組織學和遺傳學特征的3D培養物[39],且已有研究證實處于各個病期的PDAC均可培養出相應的PDO[40]。由于PDO在精準捕獲不同患者的PDAC異質性、培養的個體化迷你模型可以高效的移植入免疫缺陷鼠、精準反饋患者對藥物的敏感性以及該敏感性評估結果可在PDX模型中復現這四方面的優勢,使其已用于PDAC發生發展機制及TME特征研究,以及作為“試驗臺”對某些治療方案進行臨床前效果評估,并為精準的個體化治療提供數據指導,縮短臨床前研究與臨床實驗的時間窗[38,41]。雖然PDO具有顯著優勢,但也不可忽視其弊端:①PDO缺乏TME中的神經、血管、免疫細胞等成分,限制了該模型的應用廣度。②培養PDO使用的基質膠并不能完全復制體內的TME,且會影響藥效評估時的藥物滲透。③PDO培養所使用的生長因子等試劑可能誘發細胞基因組變異,影響研究結果。④PDO花費高,培養周期長,培養成功率低。

4 大動物模型

雖然PDO的發展提高了PDAC臨床前研究結果的可靠性,但絕大多數的模型研究還是以嚙齒鼠類為主,由于鼠類體型偏小導致某些針對介入或外科技術無法按照設想落實研究。因此,為了研究某種具備治療潛力但無法在鼠類模型驗證其功效的技術或方法,以及為了獲得一種高效的在臨床實驗之前用于評估某新型抗癌藥的臨床前研究平臺,諸如靈長類、犬類或豬等動物模型便進入研究視野[42]。非人靈長類最“像人類”,但涉及的社會和倫理問題極大限制了其應用[43]。雖然犬類在研究諸如乳腺癌、淋巴瘤等年齡相關性腫瘤方面發揮了重要作用,但它作為人類的動物伴侶以及涉及的倫理問題,亦限制了應用[44]。

目前,豬模型已用于創傷、傷口愈合、動脈粥樣硬化、囊性纖維化、杜氏肌營養不良、共濟失調性毛細血管擴張癥、臟器移植、腫瘤等方面的研究[45-48],與其他動物模型相比,豬模型具有以下優勢:①與小鼠-人類的同源率(60%～70%)相比,豬在基因組、表觀遺傳學、生理學、代謝組學和免疫學特征方面與人類具有更大的相似性(80%～90%),可用以研究腫瘤早期發病時的相關分子機制[49]。②豬的體型大小與人類相似,可用以研究某些在鼠類模型上無法使用的新診斷儀器(如影像定位、熒光監測)、治療設備(如手術器械)和技術(如導管介入、放化療)[50-51]。③豬的血容量豐富,可在腫瘤進展的不同階段多次采血研究腫瘤標志物的動態變化,甚至可將外周血中的免疫細胞功能化處理(如CAR-T治療)后再回輸入豬體內驗證細胞免疫治療的療效[52]。基于以上優勢,豬模型目前已成為大動物模型的首選。受GEMMs的啟發,Hingorani 等于2012年構建了首例類似KPC小鼠的KRASG12D; Trp53R167H雙突變轉基因迷你豬模型(oncopig cancer model, OCM),且OCM體內的任何細胞經重組酶(Cre)誘導后均可產生KRASG12D; Trp53R167H雙突變[15]。有研究于2015年利用Cre腺病毒(AdCre)體外誘導OCM的成纖維細胞產生KRASG12D; Trp53R167H雙突變后,發現其增殖周期縮短并具備了促進腫瘤細胞遷移及菌落形成的致瘤傾向,將該細胞注射入免疫缺陷鼠后可局部促瘤形成;同時,該促瘤特性在OCM的皮下和肌肉注射時也得到了復現。研究發現[53]:①將OCM來源的胰腺導管上皮細胞經AdCre體外誘導后,出現轉化表型及KRASG12D; Trp53R167H雙突變,再將這些細胞皮下移植到SCID鼠后形成組織學類似人源PDAC的瘤體。②將AdCre注射入OCM主胰管約12個月后,逐漸出現組織形態(致密的癌周圍基質成分)類似人源PDAC的胰腺癌結節。但注射過程需嚴格無菌操作,避免因局部感染導致多形性腫瘤而降低了OCM-臨床相關性。③OCM具有完整的免疫系統,能夠產生類似于人類的抗腫瘤免疫反應方便免疫治療研究。該研究也暴露了OCM的弊端:OCM是否具有普適性;如何質控AdCre的操作流程和生物安全性;GEMMs操作所用的試劑和分子工具是否適合OCM;成瘤周期長、體型大、飼養成本高。

5 其他

斑馬魚與人類祖先的差異進化已超過3億年,但兩者在某些腫瘤信號通路和調控分子方面高度同源,轉基因斑馬魚已廣泛用于PDAC基礎研究[54]。有研究于2008年構建的PTF1a-eGFP-hKRASG12V單突變斑馬魚在9個月時約70%的魚群產生了具有侵襲和轉移傾向的類似人源的PDAC,組織學呈現腺泡細胞癌、導管腺癌、黏液腺癌的多類型分化[55]。該團隊在2011年構建的PTF1a-Gal4-VP16,UAS-eGFP-hKRASG12V雙突變斑馬魚在5個月時約50%的魚群產生了類似人源的PDAC,組織學表現同前[56]。研究表明,將Mia Paca-2細胞注射入幼年和成年斑馬魚體內后均可散在成瘤,該現象可被KRAS抑制劑U0126抑制[57]。亦有學者將熒光標記的PDAC細胞注射入斑馬魚主靜脈并動態影像監測細胞轉移進程,該模型已用于研究轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化在上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及轉移中的作用機制[58-59]。

6 結語

生物模型對揭示PDAC發生發展的分子機制及臨床前綜合治療效果的評估具有重要意義,但每種模型均有其優缺點,目前尚無能夠滿足所有研究需求的生物模型。我們需結合研究目的、條件、動物福利等因素選擇合適的模型,以期最大程度的降低實驗誤差,減少資源浪費;同時需改善各模型的弊端,為PDAC基礎研究構建最符合人體實際的模型工具。只有這樣,才能更精確的認識PDAC,為后續的轉化研究提供理論支持。