貝萊斯芽孢桿菌對小曲酒釀造過程中酵母菌生長及風味物質代謝的影響

蒲領平，鄧 杰，衛春會，任志強，黃治國

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業股份有限公司，四川 遂寧 629200）

白酒為中國特有的一種蒸餾酒，多使用細菌、酵母菌、霉菌等微生物進行固態發酵而成[1-2]。隨著白酒產業的迅速發展，單一菌種發酵引起白酒風味特征同質化，商業競爭力降低的問題逐漸凸顯出來。然而，接種發酵可以通過影響微生物群落的代謝活性，進而改善發酵食品的風味。如接種地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）能夠增加醬香型白酒酒醅發酵液中的風味物質，提高感官評分[3]；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）的相互作用有利于乙酸乙酯的合成[4]。酵母菌在酒精發酵中起著主發酵的作用，芽孢桿菌類普遍存在于清香型小曲白酒酒醅中[5]，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）作為重要的釀酒功能微生物，是白酒高溫大曲的優勢菌，具有較高的產蛋白酶和產淀粉酶能力，能通過調節代謝活性，改變大曲的原生菌群、酶活性和風味成分[6]。作為一種新興的功能性菌種[7]，被廣泛應用于食品發酵領域[8-9]。貝萊斯芽孢桿菌在白酒領域的研究，主要是從大曲中分離出具有高發酵力和高活性的菌株[10-11]。目前，對于白酒中芽孢桿菌和酵母菌的基礎研究和應用研究較多[12-13]，而將貝萊斯芽孢桿菌用到強化酒醅的制作中，研究其在小曲清香型白酒釀造過程中對酵母菌影響的相關報道較少。因此有必要對貝萊斯芽孢桿菌和酵母菌之間的相互作用進行探究。

本研究通過在酒醅中強化添加不同量的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），跟蹤分析了在強化酒醅制作過程中釀酒酵母的變化，對其發酵液酒精含量進行測定，并利用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀測定固態發酵產物中總酯和高級醇含量，探究了貝萊斯芽孢桿菌對酵母菌生長及風味物質的影響，旨在為芽孢桿菌在小曲清香型白酒生產中的應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BI1：由釀酒微生物技術與應用四川省重點實驗室保藏；糖化發酵劑（釀酒曲）（含釀酒酵母109CFU/g）：安琪酵母股份有限公司；高粱、糠殼：宜賓市售。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、孟加拉玫瑰紅、葡萄糖、無水乙醇（均為分析純）：成都艾科達化學試劑有限公司；2-辛醇（2 mg/mL）、乙酸戊酯（3 mg/mL）標準品（均為色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：氯化鈉10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、胰白胨10 g/L（固體加入瓊脂粉20 g/L），pH 7.0。

孟加拉紅培養基：胰蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、孟加拉紅0.03 g/L、瓊脂粉20 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH 7.0。

發酵培養基：高粱∶水（質量比）=1∶4，加10 U/gα-淀粉酶90 ℃液化1 h，150 U/g 糖化酶60 ℃糖化3 h，過濾離心，調節糖度至10 °Bx[14]。

以上培養基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AR2140電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；LS-1201生化培養箱：上海三發科學儀器有限公司；7890A-5975B氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；A360紫外分光光度計：上海翱藝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌BI1種子液的制備

菌株的活化與保藏：挑取一環貝萊斯芽孢桿菌BI1菌體于10 mL LB液體培養基中，于37 ℃培養1 d后，取菌液分別稀釋104、105、106倍后，取100 μL菌液，涂布于LB固體培養基上，在成功獲取單菌落后再挑取單菌落進行平板劃線，活化完成后，以斜面4 ℃保藏備用。

種子液的制備：挑取一環菌體于已滅菌的LB液體培養基中，于37 ℃、120 r/min培養14 h，使菌體達到對數生長期；取3～5 mL菌液用紫外可見分光光度計測定OD660nm值，當OD660nm為1.0時，進行下一步試驗。

1.3.2 麩皮小曲制作工藝

稱取100 g麩皮和100 mL水混勻，121 ℃滅菌20 min，烘干備用。取10 mL貝萊斯芽孢桿菌種子液于15 mL離心管中，6 000 r/min離心后，將菌體接種至滅菌后的麩皮中，37 ℃恒溫培養3 d，于40 ℃烘箱中烘干后打碎備用。

1.3.3 白酒固態釀造工藝流程

參照小曲清香型白酒釀造工藝，以高粱為原料，5 L保溫桶為發酵容器，將高粱均勻粉碎，添加0.4%釀酒曲，潤糧4 h后與清水混合后蒸糧4 h，攤晾冷卻后加曲拌糠，然后25 ℃培菌，最后將酒醅放入30 ℃房間發酵15 d。按照不同的發酵時間（0 d、5 d、10 d、15 d）在上、中、下層3個點取等量樣品，混合均勻，用四分法縮分后，裝入廣口瓶中作為供試樣品。小曲清香型白酒固態釀造工藝如下：

1.3.4 貝萊斯芽孢桿菌接種順序對發酵的影響

（1）先接種釀酒酵母：在發酵培養基中接種1×106CFU/g釀酒酵母，12 h后分別接種0（空白對照組）、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g的貝萊斯芽孢桿菌，在發酵0 d、5 d、10 d和15 d取樣測生物量。

（2）先接種貝萊斯芽孢桿菌：在發酵培養基中分別接種0（空白對照組）、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g的貝萊斯芽孢桿菌，發酵12 h后接種1×106CFU/g釀酒酵母，在發酵0 d、5 d、10 d和15 d取樣測生物量。

1.3.5 測定方法

（1）酵母菌生物量的測定

稱取5 g麩曲樣品，加入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30 min。吸取100 μL菌液到1.5 mL EP管，加入0.9 mL無菌水，稀釋10倍。吸取100 μL上述稀釋液，涂布于LB培養基和孟加拉紅培養基上，分別于37 ℃培養24 h，28 ℃培養48 h。采用稀釋涂布平板法測定酵母菌生物量。

（2）固態釀造酒醅酒精度測定

稱取100 g發酵15 d的酒醅于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水混勻，緩緩加熱蒸餾，以100 mL容量瓶收集餾出液。參照國標GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的酒精計法測量酒精度。

（3）總酯和高級醇含量測定

根據文獻[15]，采用GC-MS法對發酵完成后發酵液的高級醇含量與總酯含量進行分析。

樣品測定：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》對酒醅進行處理，稱取酒醅樣本100 g，加入體積分數75%的乙醇溶液100 mL浸泡30 min，再加入100 mL去離子水，混勻，蒸餾出100 mL樣液；取900 μL樣液于進樣瓶中，加入2 mg/mL的2-辛醇內標溶液和3 mg/mL乙酸戊酯內標溶液各50 μL，隨后自動進樣。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為99.999%氦氣（He）；進樣口溫度為230 ℃；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持1 min；3 ℃/min升到46℃，6 ℃/min升到64℃，保持2min；8 ℃/min升到117 ℃，保持1 min；15 ℃/min升到230 ℃并保持5 min；載氣流速為1 mL/min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度為230 ℃；電子能量為70 eV；質量掃描范圍為20～550 amu；四極桿溫度為150 ℃。

定性方法：采用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology）05a.L標準譜庫比對，用GC-MS 化學工作站進行數據分析，并結合標準品的質譜圖進行定性。

定量方法：以2 mg/mL的2-辛醇和3 mg/mL乙酸戊酯內標溶液為標準物，檢測代謝產物的風味物質。采用內標法定量。

1.3.6 數據處理

設置3組平行，試驗結果均用“平均值±標準差”（xˉ±S）表示，采用SPSS 22.0統計分析軟件對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌與酵母菌接種先后順序的比較

糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌與糖化后接種貝萊斯芽孢桿菌發酵對酵母菌數量的影響結果見圖1。

酵母菌是白酒生產的關鍵，其生長的優劣直接影響白酒的品質和出酒率。由圖1A可知，隨著菌株BI1添加量的不斷增大，酵母菌數量呈現下降的趨勢，但都在一個數量級，菌株BI1添加量為104CFU/g發酵5 d時，酵母菌數量最大為（3.50±0.1）×108CFU/g，貝萊斯芽孢桿菌添加量為106CFU/g發酵15 d時，酵母菌數量最小為（6.98±0.4）×107CFU/g，說明酵母菌數量與該菌添加量呈負相關。由圖1B可知，糖化后接種貝萊斯芽孢桿菌的培養基中，在發酵第5～10天酵母菌的數量差異顯著（P＜0.05），發酵第5天酵母菌的數量達到峰值，這可能是因為酵母菌的生長周期短，在5 d左右就進入對數生長期；而發酵10 d后，酵母菌的數量急劇減少，可能是由于較高生物量的菌株BI1影響了酒醅的微生物區系，使酒醅中酵母菌的生長受到一定抑制，這與先前報道結果一致[16]。因此，糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌BI1更有利于白酒的發酵。

圖1 不同接種順序對酵母菌生長的影響Fig.1 Effect of different inoculation sequence on the growth of yeast

2.2 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酒精度的影響

酒精含量是酵母細胞代謝途徑和能量利用的外部表現，在白酒釀造中發揮極其重要的作用[17-19]，這說明能夠一定程度上反映出原酒出酒率和原酒質量，貝萊斯芽孢桿菌添加量對發酵液酒精度的影響結果見圖2。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酒精度的影響Fig.2 Effect of Bacillus velezensis addition on alcohol content

由圖2可知，隨著貝萊斯芽孢桿菌添加量的增加，酒精度呈下降趨勢，可能是因為細菌能夠抑制酵母菌的乙醇代謝[20]；與空白對照組相比，添加1×106CFU/g貝萊斯芽孢桿菌的菌株BI1能顯著降低發酵液的酒精度（P＜0.05），可能是由于發酵過程中微生物間營養及氧氣競爭[21-22]，導致酵母菌的產醇能力會在與其他微生物的相互作用中而改變，導致乙醇產量降低，進而酒精度下降。因此，貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響

酵母菌利用發酵原料中游離的氨基氮，從而合成自身生長繁殖所需的蛋白質，當氨基酸中的氨基被利用后，殘余的α-酮酸經過發酵脫羧與加氫還原，可以得到相應的高級醇[23]，高級醇能夠增加白酒的協調感和飽滿感，但高級醇含量過高會對白酒品質產生不利影響[24-25]，不同貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響見表1及圖3。

表1 不同添加量貝萊斯芽孢桿菌發酵液的高級醇含量Table 1 Higher alcohol contents in fermentation broth of Bacillus velezensis with different addition

圖3 貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響Fig.3 Effect of Bacillus velezensis addition on higher alcohol contents

由表1及圖3可知，3種添加量貝萊斯芽孢桿菌產高級醇能力存在明顯差異，總體上，產異戊醇最強，產2-乙烯氧基乙醇最弱，但這五種高級醇含量均低于空白對照組。隨著貝萊斯芽孢桿菌添加量的增加，總高級醇含量呈先下降后上升的趨勢，可能是因為在一定添加范圍內，貝萊斯芽孢桿菌對于抑制高級醇的產生有一定的作用[26]。然而，大量貝萊斯芽孢桿菌添加后的生物擾動改變了微生物間的代謝活性，使得總高級醇含量上升[27]；在不同菌株BI1添加量下，總高級醇含量均低于空白對照組，可能是由于菌株BI1的存在影響酵母菌代謝途徑中關鍵酶和基因等發生改變，從而減弱了醇類物質合成。綜合對總高級醇含量和對白酒的協調感的影響，最佳貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質含量的影響

酵母菌主要通過酯化反應途徑、醇酰基轉移酶途徑和醇脫氫酶途徑合成酯類物質[28]。酒醅中總酯的含量在一定程度上反映了其發酵情況，大量酯類物質有助于產生果香等[29]。貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質含量的影響見表2及圖4。

表2 不同添加量貝萊斯芽孢桿菌發酵液的酯類物質含量Table 2 Esters contents in fermentation broth of Bacillus velezensis with different addition

圖4 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質含量的影響Fig.4 Effect of Bacillus velezensis addition on esters contents

由表2及圖4可知，與空白對照組相比，添加貝萊斯芽孢桿菌后，乙酸乙酯、乳酸乙酯和癸酸乙酯的含量均有提高，其中添加104CFU/g菌株BI1條件下，乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例為1∶1，這表明此時酒體風格最佳。與空白對照相比，添加1×104CFU/g的菌株BI1能顯著增加發酵液的酯類物質含量（P＜0.05），然而添加105CFU/g菌株BI1能顯著降低發酵液的酯類物質含量（P＜0.05），這可能是由于接種了不同菌體濃度的芽孢桿菌菌株干擾了酒醅中其他微生物的生長代謝，導致發酵液中總酯含量有顯著區別。貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g時總酯含量最高，因此最佳芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

3 結論

固態發酵具有能耗低，發酵過程易于控制的優點。本試驗通過建立實驗室固態釀造模型，用貝萊斯芽孢桿菌制成麩曲添加到酒醅中發酵，研究其對小曲酒發酵過程中酵母菌生長和風味物質的影響。結果表明，糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌BI1更有利于白酒的發酵。貝萊斯芽孢桿菌對酵母有生長抑制效應，但是對固態發酵產物中酯類物質含量有一定的提高作用，強化酒醅發酵液中高級醇含量低，綜合貝萊斯芽孢桿菌BI1對酒精度、高級醇和酯類物質的影響，貝萊斯芽孢桿菌BI1最佳添加量為104CFU/g。本實驗結果對生產高級醇含量低的優質小曲清香型白酒有指導意義，但由于酒醅中微生物之間的作用較復雜，后續還需要進行更深一步的研究。