結核抗體檢測試劑國家參考品的建立

石大偉 王威 楊曉 于麗 黃嘉維 張春濤 許四宏

準確和有效地診斷結核病是控制結核病的重要手段。除了根據患者的癥狀體征，結核病的臨床診斷主要依靠影像學、病理學和實驗室檢測，實驗室檢測的主要手段有細菌學檢查、免疫學檢查和分子生物學檢查。痰涂片檢查及分枝桿菌分離培養是細菌學檢查常用的兩種檢查方法[1]。結核抗體檢測、結核菌素皮膚試驗、γ-干擾素釋放試驗都是用于肺結核診斷的免疫學實驗室檢測方法[2]。

我國國家藥品監管部門批準上市的結核抗體檢測試劑主要分為免疫層析法(主要是膠體金法)、酶聯免疫法(微孔板法)、蛋白芯片法(固相基片和免疫滲濾法芯片)。不同方法學的試劑的性能存在較大差異。免疫層析法試劑操作簡便，成本低廉，但無法進行定量檢測，且可重復性不高[3-4]。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)在2008年的一項評估發現，與痰培養的結果比較，19種商品化試劑產品的敏感度為1%～60%，特異度為5%～99%，不同試劑檢驗結果的一致性差[5]。近年來發展的酶聯免疫試劑和蛋白芯片法檢測準確性和敏感度更高，但結果報告時間較長，成本較高[5-7]。該類型的檢測試劑，在不同測試中表現存在差異，且缺乏一致的評價標準[8-10]。綜上，目前結核抗體檢測作為快速診斷方法的臨床應用受到很大限制，同時，行業共識認為該類試劑的性能和質量亟待提升和標準化[4]。因此，研制國家參考品用于結核抗體檢測試劑的質量控制及評價，對于質量提升工作具有重要意義[11]。

材料和方法

一、參考品原料

39份陽性原料樣本來自于佛山市第四人民醫院、北京老年醫院、北京萬泰生物藥業股份有限公司(簡稱“北京萬泰”)，115份陰性原料為單采血漿站報廢血漿。

二、試劑

參考品的初篩使用的結核抗體膠體金試劑為新加坡MP Biomedicals公司、艾博生物醫藥(杭州)有限公司、杭州博拓生物科技股份有限公司、北京貝爾生物工程股份有限公司(簡稱“北京貝爾”)、深圳英科新創科技有限公司生產。復核試劑包括北京萬泰、北京貝爾、上海榮盛生物藥業股份有限公司(簡稱“上海榮盛”)、成都賽普克生物科技股份有限公司(簡稱“賽普克”)和北京現代高達生物技術有限責任公司(簡稱“現代高達”)的酶聯免疫法結核抗體檢測試劑盒。候選樣本的抗體譜信息使用深圳市普瑞康生物技術有限公司(簡稱“普瑞康”)生產的蛋白芯片結核抗體檢測試劑盒獲得。協作標定的試劑還包括鄭州安圖生物工程股份有限公司(簡稱“鄭州安圖”)、深圳市安群生物工程有限公司(簡稱“深圳安群”)的酶聯免疫法結核抗體檢測試劑盒，以及北京華大吉比愛生物技術有限公司(簡稱“華大吉比愛”)的蛋白芯片結核抗體檢測試劑盒。

三、方法

1.樣本初篩和復核：使用5種國內外公司的結核抗體膠體金檢測試劑，對154份參考品原料進行篩選。將通過初篩的原料使用5種酶聯免疫法結核抗體檢測試劑進行復核。對部分原料使用蛋白芯片結核抗體檢測試劑盒進行復核，得到抗體針對結核分枝桿菌特定抗原的信息。復核后，確定參考品陽性和陰性候選樣本。

2.參考品陽性和陰性候選樣本的分組裝：對參考品陽性和陰性候選樣本進行分裝，并對其進行協作標定編號，組裝成協作標定樣本盤，存于-20 ℃冰箱中。

3.參考品陽性和陰性候選樣本的協作標定：參考品候選樣本經9家公司(北京萬泰、現代高達、北京貝爾、賽普克、鄭州安圖、上海榮盛、深圳安群、華大吉比愛和普瑞康)使用各自生產的結核分枝桿菌抗體檢測試劑(酶聯免疫法)、蛋白芯片法(固相)進行檢測。此后，對陽性參考品候選樣本進行2倍的梯度稀釋，并進行檢測，記錄每種試劑能夠檢出的最大稀釋倍數。

4.最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的分組裝：根據參考品陽性候選樣本協作標定的結果，選取適合的陽性候選樣本進行稀釋，制成最低檢出限和精密度參考品的候選樣本。對候選樣本進行分裝，并進行協作標定編號，組裝成協作標定樣本盤，存于-20 ℃冰箱中，發放各家企業進行協作標定。

5.最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的協作標定：參考品候選樣本由參與陽性和陰性參考品協作標定的9家公司使用各自生產的結核分枝桿菌檢測試劑進行檢測。記錄各個產品的檢測結果，并計算精密度參考品測試結果的變異系數(coefficient of variation，CV)值。

6.國家參考品組成和質量標準的確定：根據參考品陽性候選樣本、陰性候選樣本及最低檢測限和精密度參考品候選樣本協作標定的結果，確定國家參考品的組成和質量標準。

7.均勻性研究：根據每種候選樣本的分裝順序號，通過簡單隨機方法抽取分裝后-20 ℃保存的5套參考品，對每套參考品盤中的陽性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品用同一批北京萬泰的結核抗體檢測試劑(酶聯免疫法)分別進行檢測。按照試劑盒說明書操作，記錄檢測結果的樣本吸光度值(A值)。

8.穩定性研究：根據每種候選樣本的分裝順序號，通過簡單隨機方法各取出1套分裝后凍存的參考品于4 ℃放置7 d，于室溫(23～27 ℃)放置3 d，反復凍融3次。與凍存的參考品同時用同一批北京萬泰的結核抗體檢測試劑(酶聯免疫法)分別進行平行檢測。按照試劑盒說明書操作，記錄檢測結果的樣本吸光度值(A值)。

四、統計學處理

使用Excel 2010軟件整理和初步分析數據，采用GraphPad Prism 5.01軟件進行統計分析。使用區組方差分析的方法(two-way ANOVA)和兩兩組間比較(Bonferroni’s multiple comparisons test)對參考品的穩定性和均勻性實驗結果進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、樣本初篩和復核

樣本使用結核抗體膠體金檢測試劑進行初篩，從154份原料中選出39份陽性原料和31份陰性原料。對初篩獲得的39份陽性原料和31份陰性原料使用結核抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)進行復核，確定參考品陽性和陰性候選樣本，結果見表1。根據復核結果，選擇原則上不少于4家(陽性符合率為4/5)酶聯免疫法結核抗體檢測試劑盒復核結果為陽性的11份陽性候選樣本進行分裝和協作標定，其原料編號分別是TBK1、TBK5、TBK10、TBK11、TBK12、TBK14、TBK16、WANT3、LN2、LN14、LN17。這些樣本(TBK14和TBK16未檢測)的蛋白芯片結果均為陽性，抗體譜結果均為LAM IgG陽性，個別樣本合并有單個的相對分子質量38 000蛋白和CFP10 IgG陽性。選擇不少于3家(陰性符合率為3/4)酶聯免疫法結核抗體檢測試劑盒復核結果為陰性的15份陰性候選樣本進行分裝和協作標定，其原料編號分別是R2、R21、R27、R28、R29、R30、R32、R34、R37、R38、R43、R47、Bank293、Bank297、Bank299。最終，通過復核從初篩獲得的39份陽性原料和31份陰性原料中確定了11份參考品陽性候選樣本和15份參考品陰性候選樣本。

表1 參考品候選樣本的復核結果

續表1

二、參考品陽性和陰性候選樣本的分裝

陽性參考品候選樣本經過復核后，取一定量的樣本，充分混勻后進行分裝，裝量40 μl/支，協作標定編號為B1～11。陰性參考品候選樣本使用多次紗布過濾和反復凍融等方式處理后進行分裝，裝量40 μl/支，協作標定編號為B12～26。

三、參考品陽性和陰性候選樣本的協作標定

協作標定樣本中預期結果為陽性的部分，不同試劑間檢出的差異較大，如公司B可以檢出全部11份陽性參考品候選樣本，而公司F只能檢出6份。但對于公司B，15份陰性參考品候選樣本，出現了5份陽性結果，而其他試劑對這5份樣本的檢測結果均為陰性(表2)。同時，9家公司對參考品陽性候選樣本(不包括B11)進行了2倍的梯度稀釋，并逐一測試，直至檢出結果為陰性，記錄最高能夠檢出的稀釋倍數(表3)。

表2 陽性參考品和陰性參考品協作標定結果

表3 陽性參考品梯度稀釋協作標定結果

四、最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的分裝

最低檢出限參考品候選樣本和精密度參考品候選樣本，使用陰性樣本(原料編號：Blank937)作為稀釋基質進行稀釋。參考品陽性候選樣本B5(原料編號：TBK12)使用稀釋基質經1∶3稀釋后，使用2 ml無菌螺口凍存管分裝成400 μl/支，編號為R，作為精密度參考品候選樣本。參考品陽性候選樣本B2(原料編號：TBK5)使用稀釋基質依次稀釋至原倍的1∶4、1∶8、1∶24、1∶72、1∶128，使用2 ml無菌螺口離心管分裝成40 μl/支，作為最低檢出限參考品候選樣本，編號為S1～S5。

五、最低檢出限參考品和精密度參考品候選樣本的協作標定

9家公司的9個試劑產品參與協作標定，8個產品能夠檢出最低檢出限參考品候選樣本S1(8/9)和S2(8/9)，而S3～S5的檢出率則出現了明顯的下降，分別為3/9、2/9、1/9(表4)。精密度方面，各試劑對精密度參考品候選樣本的10次平行檢測，均可檢出陽性，其中，公司A～G的酶聯免疫法試劑的CV值分別為1.1%、4.5%、7.1%、4.6%、3.3%、7.6%、5.4%，均小于10%。而公司H的蛋白芯片法試劑相對分子質量16 000蛋白、相對分子質量38 000 蛋白、Rv1636、CFP10、Lam等靶標對應的CV值分別為5.6%、15.0%、5.9%、2.2%、13.0%；公司I的蛋白芯片法試劑相對分子質量16 000蛋白、相對分子質量38 000蛋白、MPT64、Ag85B等靶標對應的CV值分別為4.0%、4.0%、5.6%、8.4%。

表4 最低檢出限參考品協作標定結果

六、參考品組裝和質量標準的確定

根據協作標定結果，同時考慮質量標準需對產品質量提供有適當督促作用，從協作標定的候選樣本中選擇部分樣本作為國家參考品的最終組成并進行組裝。本國家參考品的組成和質量標準確定為：(1)陰性參考品N1～N10：應均為陰性，陰性參考品符合率應為10/10；(2)陽性參考品P1～P10：陽性參考品符合率≥9/10；(3)最低檢出限參考品S1～S5：S1和S2應均為陽性，S3～S5可為陽性或陰性；(4)精密度參考品R：平行檢測10次，結果應均為陽性，且檢測結果(酶聯免疫法為吸光度值，固相蛋白芯片法為發光值)的CV值應≤15%。

七、穩定性和均勻性研究

經區組方差分析，參考品的各穩定性條件處理組與-20 ℃對照組間的酶聯免疫法吸光度值差異無統計學意義。結果顯示，本參考品可于4 ℃放置7 d，于室溫(23～27 ℃)放置3 d，反復凍融3次，而不影響參考品的穩定性。

均勻性研究結果顯示，各參考品均勻性組與對照組間的酶聯免疫法吸光度值差異無統計學意義，且同一參考品各分裝樣本間差異不超出30%。由此可見，本參考品的均勻性良好。

討 論

結核病的臨床診斷金標準以痰涂片或者痰培養為主，但是其檢出率低，尤其是對涂片陰性或者無痰患者的診斷比較困難，因此，血清學結核抗體檢測日益受到重視，對臨床檢測亦有重要的參考意義[6]。本套參考品為首次研制的針對酶聯免疫法和固相蛋白芯片法結核抗體檢測試劑盒的國家參考品。本參考品的特點在于：(1)陽性候選樣本大部分來源于臨床確診的結核病患者，臨床背景信息清楚；陽性候選樣本經蛋白芯片試劑檢測，有較清楚的抗體譜信息；均為未混合的，單人份血漿，保證樣本抗體譜的清晰，有利于試劑研發和質量改進過程中進行對比研究。(2)樣本均為血漿來源，盡可能與試劑待檢的臨床樣本基質保持一致。(3)與2008年中國食品藥品檢定研究院研制的主要針對膠體金法結核抗體檢測試劑國家參考品相比，本參考品盤設置了精密度參考品及其要求，并對試劑最低檢出限稀釋度檢出提出了明確要求，有利于明確引導試劑質量改進。

為了充分驗證參考品的適用性，本參考品使用9家不同企業的酶聯免疫法和固相蛋白芯片法結核抗體檢測試劑盒進行協作標定。適用性研究的結果顯示，不同試劑的參考品陽性和陰性候選樣本檢出率有較大差異。這可能是由于不同試劑抗原的選擇和純度不同，制作工藝，試劑穩定性差異等因素所導致。在以往不同的評估和研究中，不同試劑和方法的敏感度和特異度亦存在很大的差異[12-14]。考慮到結核抗體檢測試劑的性能質量要求無國際標準，本參考品又是首次研制，按照積極引導和逐步提高的原則，筆者在選擇參考品組成時排除了個別較有挑戰性的樣本，并在設定參考品檢測結果的質量標準時將陽性參考品符合率設定為9/10，給一些試劑提高質量留出了空間，又預期能淘汰質量較差的試劑，起到一定的督促作用。同時，參考品盤的組成和檢測結果要求(質量標準)也考慮到結核抗體檢測在臨床上的應用需求，兼顧了試劑對陰性和陽性樣本的檢出能力。此外，穩定性和均勻性研究顯示本參考品的穩定性和均勻性符合規定要求。

本參考品不可避免的具有一些局限性：(1)參考品均為血漿樣本來源，因此，對于僅適用于血清樣本的試劑需要單獨驗證。(2)陰性參考品僅為正常人血漿，未設置與結核病在臨床上需要鑒別診斷的其他疾病或陽性樣本，如肺部腫瘤、肺纖維化、其他呼吸道病原體和急性感染患者的樣本。(3)與酶聯免疫法和固相蛋白芯片試劑相比，大部分免疫層析法試劑的檢測限(分析敏感度)較差，且加樣量較大(一般為100 μl，而酶聯免疫法為10 μl)導致原料不足。本參考品規定了僅適用于對酶聯免疫法和固相蛋白芯片試劑盒的質量控制和評價，后續將研制適用于其他方法學(主要涉及免疫層析法和免疫滲濾法蛋白芯片)的結核抗體檢測試劑的國家參考品。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻石大偉：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、分析/解釋數據、起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱、統計分析、獲取研究經費、行政/技術/材料支持；王威、楊曉和于麗：實施研究；黃嘉維：實施研究、起草文章、統計分析；張春濤：指導、支持性貢獻；許四宏：醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、指導