結核分枝桿菌Rv3737抑制巨噬細胞自噬促進恥垢分枝桿菌在巨噬細胞內的存活

付雪峰 婁思玉 彭章麗

遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科結核病區（貴州遵義 563000）

結核病（tuberculosis，TB）是目前十大致死性疾病之一，據2021年WHO 最新報告顯示：2020年約有987 萬結核病患者，其中以印度（26%）、中國（8.5%）和印度尼西亞（8.4%）占比較高，128 萬人左右死于結核病［1］。結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染所致的慢性傳染病。

Mtb 感染宿主后，宿主會啟動一系列免疫防御反應，如自噬、凋亡和炎癥等，通過清除入侵病原體而增強宿主防御功能［2-3］，同時，Mtb 通過一系列的機制逃逸宿主免疫系統的攻擊［4-6］，其中自噬扮演著重要的角色。目前越來越多的研究發現Mtb 的相關蛋白通過抑制巨噬細胞自噬來促進Mtb 在巨噬細胞內的存活。如Eis（N-乙酰轉移酶）［7］、PE＿PGRS47［8］、CpsA［9］等分子通過不同的信號通路抑制巨噬細胞自噬來促進Mtb 在巨噬細胞內的存活。然而僅部分蛋白發現與巨噬細胞自噬有關，是否還存在其他Mtb 相關蛋白調控巨噬細胞自噬，需進一步研究。

Rv3737 是Mtb 第3737 位編碼的蛋白，據預測，其可能的作用是一個跨膜蛋白調節蘇氨酸的代謝。有研究提出與Rv3737 高度同源的Thr 主要涉及蘇氨酸的轉運，而蘇氨酸的缺乏抑制了炎癥細胞因子的釋放及棒狀桿菌的生長，同時促進雷帕霉素的釋放，調控自噬的mTOR 信號通路［10-11］，但在Mtb 感染宿主過程中，Rv3737 具體發揮的作用及機制有待進一步研究。

本課題組前期研究結果表明Mtb 跨膜蛋白Rv3737 在臨床菌株中高表達，且與肺部病變嚴重程度及Mtb 在巨噬細胞內的復制存在一定的相關性，提示Rv3737 可能作為Mtb 的一種毒力因子而發揮作用，但具體機制尚不清楚。由于Mtb 是毒力菌株，需在生物級別P3 實驗室進行操作，且Mtb生長緩慢，給研究Mtb 相關毒力分子在巨噬細胞內的作用帶來一定的影響。隨著1998年Mtb 基因組測序成功，許多研究致力于研究Mtb 相關基因的作用及其機制。與Mtb 高度同源的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS），因無致病性、繁殖速度快，故常作為研究慢速分枝桿菌、致病性常用及等菌株的模式菌［12-13］。本研究主要通過構建過表達Mtb Rv3737 的恥垢分枝桿菌，探討Mtb Rv3737 對于恥垢分枝桿菌在巨噬細胞內存活的影響及具體機制，為結核病的治療提供潛在的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DMEM 培養基購自gibco 公司，TritonX-100、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、Western Blot 制膠液和4×蛋白上樣緩沖液購自Solarbio公司，DNA marker 和質粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司，7H9 培養基和7H10 培養基購自BD 公司，TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 購自北京全式金生物技術有限公司，Beta tubulin rabbit poly-Ab、Coralite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG二抗均購自Proteintech 公司，LC3B（D11）XP（R）購自Cell signaling 公司，4%多聚甲醛通用型組織固定液購自biosharp 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建pMV261-Rv3737 融合表達質粒采用酚-氯仿（CTAB）法提取Mtb H37Rv 全基因組DNA，并通過設計合成含有pFlag 標簽的Rv3737 相關引物pMV261-Rv3737-ECORI-F（CCGGAATTCCGGATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGATCAAGATCGATCGGACAACAC）和pMV261-Rv3737-HindIIIR（CCCAAGCTTGGGCTAGCGCACCTCGGTCGCG）擴增Mtb Rv3737 基因。將質粒pMV261 和目的基因Rv3737 經過雙酶切、連接、轉化進大腸桿菌，在含Kana（25 μg/mL）抗性的LB 固體平板上挑取單克隆點，擴大培養16 ～18 h 后提取菌液的DNA，并經雙酶切及測序驗證pMV261-Rv3737 融合表達質粒。

1.2.2 構建過表達MSRv3737 的恥垢分枝桿菌（MS：：pMV261-Rv3737）培養恥垢分枝桿菌至生長對數期，即OD6000.6 ～1.0，并制備恥垢分枝桿菌感受態細胞，將驗證成功的重組質粒pMV261-Rv3737 和空載質粒pMV261 通過電轉化技術電轉至感受態細胞中，在無抗性的7H9 液體培養基中復蘇細菌2 ～3 d，再轉至含Kana 抗性的7H10 固體平板中培養1 周后提取單克隆生長菌落，并將單隆菌落在7H9 培養基中擴大培養，并通過PCR 和Western blot 技術驗證恥垢分枝桿菌中Rv3737 的表達，PCR 引物為（F：CTCAGTATCCTGCTGACCG；R-CCAGCCTCGCCAGCGCCGAC）。

1.2.3 MS：：Rv3737 及MS：：pMV261 的存活試驗MS：：Rv3737 過表達菌株和MS：：pMV261 的胞外存活試驗：將MS：：Rv3737 過表達菌株和MS：：pMV261 在含有卡那霉素的7H9 液體培養基中生長，通過OD600檢測恥垢分枝桿菌生長處于對數生長期，取適量菌液加入到100 mL 的7H9 培養基中，將菌液的初始OD值調至0.02，于37 ℃250 r/min恒溫搖床中培養，每間隔6 h 測定1 次OD值，并記錄。MS：：pMV261pMV261Rv3737 過表達菌株和MS：：pMV261 的胞內存活試驗：準備RAW264.7 細胞鋪板于六孔板中（5 × 105/孔），10 %DMEM 37 ℃培養12 ～18 h，將MS：：Rv3737 及MS：：pMV261菌株以MOI＝10 感染RAW264.7 細胞4 h，用1×PBS清洗2～3 遍，用阿米卡星（1∶2 000）藥殺0 、6、12、24、48、72 h 等不同時間，在不同時間點棄細胞上清，并用1×PBS 清洗細胞2 ～3 遍，用1 mL 0.1%Triton X-100 裂解巨噬細胞，將裂解液稀釋至10-5和10-7倍數，并取25 μL 涂板于7H10 固體平板中，1 ～2 周后觀察細菌生長情況并計數。

1.2.4 Western blotMS：：pMV261-Rv3737及MS：：pMV261 感染RAW264.7 細胞8 h 后，用1xPBS 洗滌細胞2 ～3 遍，每孔中加入150 μL 的RIPA 組織裂解液及PMSF（1∶100），置于冰上裂解30 min 后，加入4×loading 蛋白上樣緩沖液，在100 ℃沸水中處理15 min 使蛋白變性。用12%SDS-PAGE 分離膠及5%濃縮膠進行電泳（電泳條件：80 V、30 min 出孔，100 V，2 h 蛋白分離），將分離的蛋白經電轉至PVDF 膜上（電轉條件：150 V、0.4 A、2 h），再用5%脫脂奶粉于室溫下封閉90 min，用5%脫脂奶粉將一抗LC3Ⅱ（cell signaling technology）稀釋2 000倍后于4 ℃條件下孵育PVDF 膜過夜，0.1%的PBST洗滌3 遍，再以抗兔IgG 二抗（1∶5 000）于室溫下孵育2 h，0.1%的PBST 洗滌3 遍后，加入適量的ECL發光液，在Amersham Imager600曝光機下曝光，Image J 進行灰度掃描分析結果。

1.2.5 激光共聚焦培養RAW264.7 細胞，并將細胞鋪板于八孔皿中（3 × 104/孔）后過夜處理；將MS：：pMV261-Rv3737 及MS：：pMV261 感染巨噬細胞4 h；棄掉培養上清，用1 × PBS 清洗3 遍后，每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，放置于37 ℃孵箱中固定30 min；吸掉4%多聚甲醛，用1 × PBS 清洗3 遍，加入200 μL的0.1%TritonX-100于室溫下穿膜5 min；棄掉0.1 %TritonX-100，用1 × PBS 清洗3 遍，并加入200 μL 的3 %BSA 封閉液于室溫下封閉1 h；封閉完成后，再用1 × PBS 清洗3 遍，按1∶200 的比例加入一抗（anti-LC3B）（注意避光條件下操作），于4 ℃條件下過夜處理；用1 × PBS 清洗3 遍后，用1 %BSA 溶液按1∶500 比例稀釋二抗（Dylight 488-labeledAntibody To Rabbit IgG），并加入100 μL 二抗于室溫條件下孵育1 h（避光操作）；孵育結束后，用1 × PBS 避光迅速清洗3 遍，加入Hoechst 33342，室溫條件下染色15 min（避光操作）；染核結束后，用1 × PBS 避光清洗5 次，并加入300 μL 的1×PBS，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照并記錄。

1.3 統計學方法所有實驗均采用3 個及以上獨立樣本數據的均值進行比較，使用GraphpadPrism 8.0 軟件進行統計分析，兩組間行t檢驗確定組間的統計學顯著性，3 組及3 組以上采取Two-Way ANOVA 進行比較，當P＜0.05 時，則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建過表達Mtb Rv3737 的恥垢分枝桿菌菌株為研究Rv3737 在Mtb 感染巨噬細胞過程中的作用，通過PCR 擴增Mtb Rv3737 全基因組序列，并與穿梭質粒pMV261 構建融合表達質粒pMV261-Rv3737，并將pMV261-Rv3737 融合表達質粒電轉至MS 感受態細胞中，以建立過表達Mtb Rv3737 的MS，即MS：：pMV261-Rv3737，并通過PCR（圖1A）及Western blot（圖1B）鑒定目的基因Rv3737 及pFlag 的表達，結果表明成功構建過表達Mtb Rv3737 的MS 菌株。

圖1 PCR 和Western blot 驗證過表達Rv3737 的恥垢分枝桿菌菌株Fig.1 Verified the over-expressed Rv3737 in the Mycobacterium smegmis through PCR and Western blot

2.2 Rv3737 不影響MS 的胞外生長，但能促進MS在巨噬細胞內的存活由于Mtb 與宿主細胞長期共存的過程中，Mtb 通過一系列機制逃逸宿主免疫系統的攻擊從而促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，本課題組前期研究也發現Rv3737 可能作為毒力因子參與Mtb 菌在巨噬細胞內的存活。因此，本研究MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 通過檢測OD600及菌落計數的方法進一步探討Rv3737對MS 在體外及巨噬細胞內存活的影響。首先，MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 在含有卡那霉素的7H9 液體培養基中生長，檢測OD600，繪制生長曲線圖，結果（圖2A）表明過表達Mtb Rv3737 不影響MS 的體外生長。其次，將MS：：Rv3737 和MS：：pMV261 以MOI=10 感染RAW264.7 細胞后，通過菌落計數檢測菌落數的改變，結果（圖2B）顯示Rv3737 促進了MS 在巨噬細胞內的存活。

圖2 Rv3737 對于Ms 的體外生長及巨噬細胞胞內存活的影響Fig.2 The survival of Rv3737 in vitro and Mycobacterium smegmis-infected macrophages

2.3 Rv3737 抑制MS 感染巨噬細胞的自噬越來越多的研究認為，Mtb 相關毒力基因通過抑制巨噬細胞自噬從而促進Mtb 在巨噬細胞內的存活，且既往研究認為與Rv3737 高度同源的ThrE 可能通過影響mTOR 信號通路調控棒狀桿菌的存活［10］，為進一步探討Rv3737 是否通過影響巨噬細胞自噬從而促進Ms 在巨噬細胞內的存活。將MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 菌株感染巨噬細胞8 h，通過Western blot 檢測自噬相關蛋白LC3II的變化及激光共聚焦檢測LC3 自噬點的改變，結果（圖3A、B）表明MS：：pMV261-Rv3737 組與MS：：pMV261 組相比，MS：：pMV261-Rv3737 感染巨噬細胞組LC3II 表達量明顯降低；激光共聚焦結果表明過表達Rv3737 組感染巨噬細胞后，巨噬細胞內綠色熒光標記的自噬點明顯減少，表明Rv3737 抑制了MS 感染巨噬細胞自噬點的產生。綜上所述，Rv3737 抑制了MS 感染巨噬細胞的自噬信號通路。

圖3 Rv3737 抑制恥垢分枝桿菌感染巨噬細胞的自噬Fig.3 Rv3737 inhibited the autophagy of Mycobacterium smegmis-infected macrophages

3 討論

Mtb 的不斷蔓延，尤其是耐藥結核分枝桿菌的出現，給結核病的治療帶來了嚴重的威脅。Mtb 與巨噬細胞長期共存的過程中，Mtb 在宿主細胞內表現出強大的生存能力，這主要是由于Mtb 產生了許多毒力因子，從而抵抗宿主免疫系統的攻擊。本課題組前期研究發現，作為Mtb 跨膜蛋白的Rv3737 在臨床菌株中呈高表達趨勢，且與肺部嚴重程度及Mtb 的復制存在一定的相關性，表明Rv3737 可能是Mtb 的重要毒力因子。且既往研究認為，與Rv3737 高度同源的ThrE 涉及蘇氨酸的轉運［10］，而自噬信號通路中的主要因子mTOR（雷帕霉素）作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶來影響細胞的生存和繁殖［14］。由于目前尚無相關文獻報道Mtb跨膜蛋白Rv3737 的功能及其機制，因此本研究旨在探索Rv3737 對Ms 與宿主之間相互作用的影響。

Ms 具有無致病性、繁殖速度快等優點，常作為研究Mtb 功能及其作用機制的模式菌［12-13］。本研究主要通過將Mtb 的Rv3737 轉入MS 中，構建過表達Rv3737 的菌株模型，以探索Rv3737 對MS 與巨噬細胞之間相互作用的影響。本研究通過MS感染刺激巨噬細胞后檢測其胞內MS 的存活情況，發現過表達Rv3737 可促進MS 在巨噬細胞內的存活，通過胞外生長實驗發現Rv3737 對MS 體外生長并無明顯影響，表明Rv3737 的表達確實促進了MS 在巨噬細胞內的存活。YANG 等［15］發現Mtb 表面相關蛋白Rv1515c 在MS 中過表達促進了MS 在胞內的存活，且GONG 等［16］報道的Rv3717 蛋白也可通過靶向凋亡通路以促進MS 在胞內的存活，而ALI 等［17］的研究發現Rv1523 可能通過干預細胞壁脂質的組成而促進Mtb 在巨噬細胞內的生存。

自噬是一種復雜的胞內降解過程，其主要通過吞噬降解外來入侵的病原體，增強宿主細胞的免疫防御功能，自噬在Mtb 的發病機制中扮演者重要角色［18］。然而，Mtb 在被巨噬細胞吞噬后，長期暴露在缺氧、酸性及營養缺乏的環境中，逐漸形成了抵抗宿主殺傷的免疫逃避機制［19］。為進一步探討Rv3737 促進MS 內存活是否通過調節巨噬細胞自噬發揮效應，本研究將過表達Rv3737 的MS感染刺激巨噬細胞，結果表明Rv3737 明顯抑制了巨噬細胞的自噬。因此，我們初步推測，跨膜蛋白Rv3737 可能通過抑制巨噬細胞自噬而促進MS 在巨噬細胞內的存活。PADHI 等［20］的研究發現Mtb的毒力蛋白LprE 也可通過抑制自噬通路來促進分枝桿菌的存活，其具體機制在于干擾了自噬通路中自噬體-溶酶體的融合階段。此外，Eis［21-22］、ESAT6［23］、PE＿PGRS41［24］、pknG［25］及PPE51［26］等Mtb 相關蛋白也可通過調控自噬途徑而有利于Mtb 的持續存在。但就Rv3737 抑制巨噬細胞自噬的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究將Rv3737 轉入MS 中以構建Rv3737 過表達菌株，發現Rv3737 并不影響MS的體外生長，但能促進MS 在巨噬細胞內的存活，且Rv3737 抑制了巨噬細胞的自噬，由此推測Mtb Rv3737 可能通過抑制巨噬細胞的自噬從而促進MS 在巨噬細胞內的存活，為結核病的治療提供潛在的靶點［27］。

【Author contributions】FU Xuefeng performed the experiments andwrote the article. LOU Siyu performed the experiments. FU Xuefeng and PENG Zhangli revised the article. PENG Zhangli designed the study and reviewed the article. All authors read and aplproved the final manuscript as sub-mitted.