酶聯免疫雙抗原夾心法檢測HCV抗體的應用與分析

孫鵬 嵇俊

丙型肝炎是由丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一種以肝損害為主的一組全身性傳染病疾病,其可發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，給患者的生命安全帶來了嚴重的威脅[1]。我國是丙型肝炎的高流行區，傳播途徑以輸血、針刺及吸毒等方式為主，其中輸血傳播較常見，經輸血、血液制品傳播疾病[2-3]，流行病學顯示，此病在全球中感染率約占3%，感染者約有2億人，每年新發丙型肝炎病例約3.5萬例，其中50%～80%的感染者無明顯癥狀并可進展為慢性感染，20%的感染者最終可進展為肝硬化甚至肝細胞癌[4-6]。且由于患病率逐年升高，已成為嚴重的社會、公共衛生問題。由于目前尚無疫苗和特效藥物，對無償獻血人群進行的篩查和早期診斷已成為控制臨床輸血性丙型肝炎傳播的重要手段。血站目前普遍采用第三代間接法檢測抗-HCV，該方法檢測能力雖有所提高，但在靈敏度、特異性以及檢測窗口期方面仍存在明顯不足，如何進一步提高酶聯免疫法HCV抗體的檢測效能，成為采供血機構亟待解決的問題之一。有鑒于此，實驗室擬對優化的第四代雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑進行驗證，并在實踐中加以引進和應用。現將工作匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為，（1）選擇2020年10月13日—2021年12月31日在淮安市中心血站無償獻血陰性樣本83 209例，2020年第三代試劑抗-HCV單試劑陽性而HCV-RNA檢測陰性標本28例，合計83 237例。（2）11例陽性樣本:經江蘇省血液中心確認抗-HCV為陽性歸隊樣本5例；HCV抗體酶免陰性而HCV-RNA陽性樣本2例；2020年衛健委臨檢中心測評HCV-RNA陽性樣品4例，合計11例。（3）北京康徹思坦丙型肝炎病毒抗體性能驗證血清盤精密度樣本24例，陰性及陽性樣本各20例。

1.2 方法

（1）采用試劑盒內的陰、陽性對照和抗-HCV質控品，在不低于10 d試驗運行前提下，累計進行至少20批次常規檢測，每批次試驗包括空白對照1孔，陽性對照2孔，陰性對照3孔，室內質控1孔，匯總各批數據分析其重復性。（2）取參考血清盤中精密性樣品（0.1 NCU/mL），在不低于10 d試驗運行的前提下，累計進行24次常規檢測；將上述標本插入常規標本序列，一批內進行24次檢測。匯總各組數據，計算其批間、批內精密度。（3）取參考血清盤中已知血清狀態標本共40份，插入常規檢測，匯總數據計算其敏感性、特異性和準確度。（4）取江蘇省血液中心新近確認HCV核酸陽性歸隊標本、以往HCV酶免陰性而核酸陽性標本、2020年衛健委室間質評核酸陽性標本，共計11例作為HCV抗體確證陽性試驗組；取原第三代酶免試劑陽性而核酸陰性標本、本室2020年10月13日—2021年12月無償獻血者陰性樣本，二者共計83 237例（以核酸檢測結果為確認標準），作為HCV抗體確證陰性試驗組。匯總各組檢測結果并做統計分析。

儀器與試劑：加樣設備為Microlab Star全自動加樣儀，由瑞士哈美頓博納圖斯股份公司提供。全自動酶聯免疫后處理系統為FAME24/20，由瑞士哈美頓博納圖斯股份公司提供。均定期檢定校驗合格。

北京萬泰雙抗原夾心法酶聯免疫抗-HCV檢測試劑（批號CS20200708、CS20200810、CS20201114、CS20210101、CS20210507、CS20210810）、廈門新創間接法酶聯免疫抗-HCV檢測試劑（批號2019125825）、上海科華間接法酶聯免疫抗-HCV檢測試劑（批號202002041、202008121、202008141、202102041、202106151）。北京康徹思坦室內質控品（抗-HCV含量0.05 NCU/mL，批號: 202005010、202007002、202107013）、北京康徹思坦肝炎病毒抗體性能驗證血清盤（批號J202004002），均按照使用說明要求操作并在有效期內使用。

1.3 觀察指標

（1）酶聯免疫吸附法（ELISA）樣品反應孔吸光度值（absorbance，A）＜臨界值（cut off，CO），判為HCV抗體陰性；樣品反應孔A值≥臨界值（cut off，CO），判為HCV抗體陽性。

（2）重復性試驗符合率=樣本實際陰性（陽性）數/血清盤確認陰性（陽性）數×100%；精密度試驗以樣本吸光度值/臨界值（S/CO）作為統計觀察指標，計算S/CO均值和變異系數（coefficient of variation，CV）。

本文參照國家標準《血站技術操作規程（2019 版）》中關于重復性和精密度試驗的執行標準執行：重復性試驗可接受標準為20次檢測結果不能出現大于1次陰性陽性對照不符合生產商要求；精密性試驗可接受標準為批內變異系數應在15%以內，批間變異系數應在20%以內；

（3）敏感性=真陽性例數/診斷金標準陽性例數×100%；特異性=真陰性例數/診斷金標準陰性例數×100%；準確度=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%；陽性檢出率=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性檢出率=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。

1.4 統計學方法

用統計軟件SPSS 23.0統計學軟件進行統計學分析，計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陰、陽性對照重復性試驗結果

由陰、陽性對照重復試驗可知：60孔陰性對照A值均≤0.1，符合率達到100%；40孔陽性對照OD值均≥0.80，符合率達到100%。此外，20孔空白對照在正常試驗條件下未出現異常的顯色或波動，符合率達到100%；20孔室內質控血清的吸光度值/臨界值也均處于2～5之間。說明第四代試劑在本室的應用能夠較好地滿足實驗要求。

2.2 批內、批間精密度試驗結果

參考血清盤精密性樣品（0.1 NCU/mL），按既定方案進行批內和批間精密度試驗，批內和批間精密度均符合血站技術操作規程（2019）版相關規定，詳見表1。

表1 批內和批間試驗樣本S/CO數據統計表

2.3 敏感性、特異性試驗結果

取參考血清盤中已明確血清狀態的陰、陽標本共40份，插入常規標本一同檢測，共檢出20份陰性和20份陽性結果，與參考血清盤真值符合率達100%。同時，按照單一檢測方法2×2四格表資料統計，分別計算其敏感性和特異性，均為100%。說明該試劑盒在對各濃度參考學清樣本具有很好的檢出與鑒別能力。

2.4 第四代與第三代試劑平行比對實驗結果比對

經第四代與第三代試劑的平行比對，其中陽性對照組11例，第四代試劑陽性檢出率為81.82%，第三代試劑陽性檢出率為27.27%，第四代試劑敏感性明顯高于第三代試劑，差異有統計學意義（χ2=3.342，P＜0.05）；陰性對照組83 237例，第四代試劑陰性檢出率為99.99%，第三代試劑陰性檢出率為99.88%，第四代試劑特異性為99.99%，高于第三代的99.88%，差異有統計學意義（χ2=32.238，P＜0.05）。以上數據說明第四代試劑較第三代試劑在靈敏度和特異性等核心指標方面均表現出明顯的優勢。詳見表2。

表2 第四代與第三代試劑平行試驗數據統計（例）

3 討論

丙型肝炎是丙肝病毒主要通過輸血及血制品傳播導致的一種嚴重傳染性疾病，為達到控制輸血傳播HCV、保障臨床供血安全的目標，必須采用敏感準確的方法對無償獻血的血樣進行相關篩查。酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）方法作為HCV抗體檢測的重要手段，之前曾歷經三代的技術發展。最早由美國Chiron公司于20世紀80年代末利用丙肝病毒抗原重組C100-3融合蛋白，構建出首代HCV抗體檢測方法。它可在感染丙肝病毒12～26周后檢測出抗體，但因其僅針對非編碼抗原NS4區域設計，造成特異性差、靈敏度也較低。90年代初，出現以丙肝病毒抗原NS3區C33C與NS4區融合表達抗原C200、合并C區核心抗原C22-3作固相包被的第二代HCV抗體檢測試劑盒。它彌補了首代方法的部分不足，使HCV抗體檢測的敏感性和特異性有所提高。研究顯示，其檢出率較首代檢測方法提高5%～40%，同時由于抗C33C比抗C100-3早出現30～90 d，可使窗口期進一步縮短至10周左右。進入21世紀，國內的采供血機構已經普遍采用第三代酶聯免疫間接法檢測HCV抗體，它是在第二代的基礎上，增加了一個非編碼抗原NS5，不僅提高了檢測的靈敏度和特異性，還令檢驗窗口期又縮短了1周左右。總體而言，這些EIA檢測抗體技術兼具價格低廉、快捷簡便、自動化程度高等優點，但基于方法學上的缺陷，其不可避免易受諸多因素的影響，如試劑抗原、抗體與酶結合物不純；獻血者血樣溶血或有高免疫蛋白、類風濕因子和超氧化物歧化酶等的存在；操作過程中加樣時間、孵育狀態、震蕩程度、洗板效果等因素的波動均會造成檢測結果的偏差。尤其需要關注的是其窗口期問題，由于丙肝病毒從感染到抗體產生期限較長，造成其血清轉陽時間也偏長，需進一步縮短檢出周期才能切實減少威脅輸血安全的隱患[8-10]。

血站目前普遍采用第三代間接法檢測抗-HCV。科學研究表明，人體感染丙肝病毒后，機體出現的生理性免疫學反應具有一定的規律，由于IgG類抗體出現的時間遲緩,造成目前采用酶聯免疫間接法來檢測的第三代HCV抗體試劑，對早期感染者采集的血樣不夠敏感，且眾多的干擾因素，還會導致一定的假陽性。西部戰區總醫院就曾對獻血者中經2個廠家試劑ELISA HCV抗體試劑進行檢測為陽性的137份樣本進行重組免疫印跡法確證，假陽性率高達35.29%[11]。本次研究所涉及的酶免雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑，采用基因工程重組表達抗原作為原料取代原先使用的酶標二抗，提高了檢測特異性，隨著灰區和假陽性標本的大量減少，避免了不必要的獻血資源的浪費及醫療糾紛。其次，該試劑在間接法檢測IgG的基礎上，增加了針對IgM類抗體的檢測，由于IgM在人體的免疫反應中早于IgG出現，這樣就可使窗口期提前7～30 d；同時，借助生物素-親和素級聯放大技術也提高了檢測靈敏度，其最低檢出限可達0.2 NCU/mL，降低了丙肝病毒的傳播風險；另外，雙抗原夾心法HCV抗體檢測利用對抗體進行兩次特異性反應，形成包被抗原-抗體-標記抗原復合物，可降低間接酶聯免疫吸附法引起的假陽性[12]；其加樣量由間接法的10 μL提高到50 μL，避免掛針等造成的誤差，保證了實驗操作的穩定性和檢測的重復性，也降低輸血的風險以及血液篩查的成本。

綜上所述，在目前血站行業標準為開展核酸檢測同時至少進行1次血清學檢測，且采用先血清學檢測再對陰性標本進行核酸篩查的檢驗策略為背景下,通過本次研究并立足長遠考量，不管是對雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑自身精密度、重復性、敏感性、特異性、抗干擾性以及最低檢出限的驗證，還是與第三代酶免間接法HCV抗體試劑的比對，均顯示出雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑優越的檢測性。選擇酶免雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑相較于第三代酶免間接法試劑，不僅靈敏度高，能有效降低傳播風險，而且假陽性少，可減少不必要的血液資源浪費，避免給獻血者帶來無謂的心理負擔，在一定程度上減少獻血者的流失。此外，應用雙抗原夾心法HCV抗體檢測試劑也能更好地整合并發揮血清學與核酸聯檢的效能，進一步促進無償獻血工作的開展、提高臨床用血安全的保障水平。