組蛋白甲基化轉移酶SETD4對鼻咽癌細胞增殖和遷移的影響*

封慕茵， 鄭阿秀▲， 白建榮， 曾玉梅， 羅泊濤， 申志華△， 揭偉，2，3△

組蛋白甲基化轉移酶SETD4對鼻咽癌細胞增殖和遷移的影響*

封慕茵1， 鄭阿秀1▲， 白建榮1， 曾玉梅4， 羅泊濤1， 申志華1△， 揭偉1，2，3△

（1廣東醫科大學基礎醫學院病理學系，廣東 湛江 524023；2海南醫學院第一附屬醫院腫瘤內科，海南 海口 570102；3海南醫學院腫瘤研究所，海南 海口 571199；4中山市人民醫院病理科，廣東 中山 528400）

明確組蛋白甲基化轉移酶含SET結構域蛋白4 （SET-domain-containing protein 4， SETD4）在臨床鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）組織中的表達，分析SETD4對NPC細胞增殖和遷移的影響。采用免疫組織化學法檢測86例臨床NPC標本與對照組30例鼻咽黏膜慢性炎癥（nasopharyngeal chronic inflammation， NPI）組織中SETD4蛋白的表達；基于CRISPR/Cas9技術敲除CNE2細胞中基因，DNA測序結合半定量RT-PCR進行鑒定；以敲除前后的CNE2細胞為研究對象，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，采用CCK-8實驗分析細胞增殖活性、Transwell實驗觀察細胞遷移能力變化、Western blot檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、細胞周期相關蛋白、上皮-間充質轉化標志物和組蛋白賴氨酸甲基化的變化，并通過生物信息學富集相關聯的功能和信號通路。SETD4蛋白主要定位于NPC細胞核中，NPC組織中SETD4陽性表達率顯著低于NPI對照組（<0.01）。基于CRISPR/Cas9技術成功敲除了CNE2細胞的基因，獲得基因敲除的純合子細胞。與野生型（wild-type， WT）細胞株相比，敲除（knockout， KO）細胞株呈現更明顯的梭形和多角形，增殖活性和遷移能力均顯著增加（<0.01），E-cadherin和p21蛋白表達顯著下調（<0.05），而cyclin D1、cyclin E1、N-cadherin和vimentin蛋白表達則顯著上調（<0.05）。此外，與WT組相比，KO組細胞中H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K27me3、H3K79me2和H4K20me2水平顯著降低（<0.05）。基因集富集結果顯示，與細胞周期的功能和信號通路相關。臨床NPC組織中SETD4蛋白的表達減弱或缺失；SETD4表達減弱通過上調細胞周期相關蛋白促進NPC細胞增殖，通過誘導上皮-間充質轉化而促進細胞遷移；SETD4影響NPC細胞中H3K4、H3K9、H3K27、H3K79和H4K20多個位點的甲基化。

鼻咽癌；組蛋白甲基轉移酶；含SET結構域蛋白4；細胞增殖；細胞遷移；基因集富集

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma， NPC）是起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤。遺傳易感性和腫瘤微環境因素的脅迫與NPC發病和進展有很強的相關性［1-2］，而環境脅迫往往帶來表觀遺傳修飾的改變［3-4］。組蛋白甲基化修飾被認為是表觀遺傳修飾中重要的方式之一［5］。含SETD結構域蛋白4（SET domain-containing protein 4， SETD4）作為組蛋白甲基化的重要成員之一，主要由位于羧基末端的SET結構域和位于氨基末端的底物結合結構域組成。其中SET結構域因其共同存在于果蠅的三個調節因子Su（var）3-9、E（z）、和Trithorax的羧基末端而得名，而含SET結構域的蛋白統稱為 SET 家族蛋白［6］。SET家族蛋白普遍具有組蛋白和非組蛋白甲基化轉移酶的功能，通過甲基化的修飾作用能夠調控基因表達。課題組前期的研究提示對組蛋白H3K4，H4K20的甲基化有影響［7］，但迄今對基因的功能研究相對較少，特別是有關與腫瘤關系的報道不多［8-9］，本研究首次探討基因與NPC的關系，旨在基于表觀遺傳修飾角度為NPC的發病機制提供新的證據。

材料和方法

1　細胞系與臨床組織樣本

穩定表達Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1的低分化NPC細胞系CNE2為我室構建。86例NPC和30例鼻咽黏膜慢性炎（chronical nasopharyngeal inflammation，NPI） 患者的石蠟包埋組織來自2017～2019年中山市人民醫院病理科保存的標本蠟塊。NPC患者組織學類型均為非角化型未分化性癌，患者均為首次就診且未接受任何治療。NPC患者平均年齡（46±6）周歲，對照NPI患者平均年齡（45±4）周歲。臨床石蠟包埋組織標本使用符合中山市人民醫院有關倫理規定。

2　主要試劑及儀器

RPMI-1640培養液（HyClone）；胎牛血清（GIBCO）；人Cas9過表達質粒（賽業生物科技有限公司）；SETD4 Ⅰ抗（Novus biological）；β-actin Ⅰ抗（Santa Cruz）；PCNA Ⅰ抗（CST）；E-cadherin、N-cadherin、vimentin、cyclinA2、cyclinD1、cyclinB1、cyclinE1、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases）2、CDK4、CDK6、p21等Ⅰ抗均為武漢三鷹生物技術有限公司產品；組蛋白相關H4K20me1、H4K20me2、H4K20me3、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3等Ⅰ抗均為Abcam產品；H3、H4、H3K4me1、H3K27me1和H3K27me2等Ⅰ抗均為南京Bioword產品。PCR引物（生工生物工程股份有限公司）；細胞培養箱（Espec）；熒光定量PCR儀（Light Cycler 480 Ⅱ）；凝膠成像分析系統（ Tanon）；倒置顯微鏡（Micro Star AO）。

3　方法

3.1免疫組織化學染色參照既往方法進行［10］。簡言之，臨床NPC組織與對照NPI組織標本的石蠟包埋切片后經系列二甲苯脫蠟和乙醇處理，切片置檸檬酸鹽緩沖液中行熱抗原修復，用3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶阻斷劑，PBS緩沖液洗滌后滴加SETD4 Ⅰ抗（1∶500），置于4 ℃冰箱中過夜孵育，PBS溶液沖洗3 min×3次，滴加適量辣根酶標記的羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min，PBS溶液沖洗2 min×3次，DAB顯色；蘇木精復染；1%鹽酸分化；自來水沖洗返藍；脫水，封片，鏡檢。SETD4表達評分如下，首先按陽性細胞數評分：無陽性細胞為0分，<10%為1分，≥10%但<50%為2分，≥50%為3分，≥75%為4分；其次按顯色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。數據分析時，綜合兩者分數相乘總分≥6分為高表達。

3.2NPC細胞培養及基因敲除CNE2細胞用含10%胎牛血清、RPMI-1640完全培養液重懸，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱內培養。每2 d換液，待貼壁細胞融合率達80%以上后，用0.25%胰酶消化傳代，待細胞擴增至對數生長期后用于相關實驗。設計針對人基因的sgRNA并排除脫靶現象。CNE2細胞接種于6孔板中，待細胞生長匯合至60%左右，采用電轉染法將sgRNA、Cas9過表達質粒共轉染至CNE2細胞中。sgRNA信息：sgRNA-#1為5’-TAAAGTCCACGGTGCTCTTTAGG-3’， sgRNA-#2為5’-CATGAGACCCCTCATACTCTTGG-3’。72 h后將細胞胰酶消化后以每孔一個細胞接種于96孔板，常規換液，待細胞長出單克隆后進行基因型鑒定。對初步鑒定為純合子的2B9和2C10克隆再次進行DNA測序驗證。提取2B9和2C10細胞mRNA，再進行mRNA表達的檢測。后續細胞學實驗均以被敲除的2B9細胞為敲除（knock out，KO）組、以未敲除的CNE2細胞為野生型（wild type，WT）組進行。

3.3CCK-8法檢測細胞的增殖活性參考既往方法進行操作［11］。細胞按每孔2×103個/接種于96孔板內，過夜孵育貼壁。按貼壁后培養時間0 h、24 h、48 h及72 h每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃繼續孵育2 h，酶標儀上讀取450 nm 吸光度（），每組5個復孔，實驗重復3次。

3.4Transwell實驗參考既往方法進行操作［11］。用含0.5%胎牛血清的RMPI-1640培養液重懸細胞，取2×104個細胞接種于Transwell小室上室，總體積200 μL，下室中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液500 μL；將24孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內孵育24 h，棄去培養液，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，吸走多聚甲醛，用干凈的棉簽擦拭小室內表面，加入0.1%結晶紫染液染色30 min；用棉簽小心擦除小室的上室面細胞，顯微鏡下觀察并拍照。以穿膜的細胞數差異代表細胞運動能力的改變。每張膜選5個固定視野，計算平均細胞數，每組重復3孔。

3.5PCR采用哺乳動物基因組DNA提取試劑盒提取細胞DNA，PCR檢測基因的DNA片段以分析細胞的基因型。PCR反應引物F1：5'-CTCACAGGAACAGCTGGAG-3'； R1：5'-ACAAGGCTGAAGCTGGATGT-3'；F2：5'-CAGGTTGTGGGTCTTGGAAC-3'；R2：5'-CATATGTACACATCTGAGTGCAAG-3'；PCR反應Tm值為62 ℃，按F1-R1，F2-R2和F1-R2引物組進行PCR反應。提取細胞總RNA，取1.0 μg總RNA逆轉錄為cDNA，采用半定量RT-PCR鑒定基因敲除單克隆細胞中mRNA水平。SETD4上游引物為5'-CTGAAGAGCAGAGAGCCCAC-3'，下游引物為5'-ACGCTGCTTTTACCTGGACAT-3'，產物長度260 bp。β-actin上游引物為5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游引物為5'-ACAGGACTCCATGCCCAGG-3'，產物長度200 bp， Tm值均為60 ℃。采用定量PCR檢測PCNA mRNA的水平，PCNA上游引物為5'-TCCCTTACGCAAGTCTCAGC-3'，下游引物為5'-GAGTCCATGCTCTGCAGGTT-3'，Tm值為60 ℃；內參照β-actin引物同上。

3.6Western blot參考既往方法進行操作［12-13］。提取細胞總蛋白，用BCA法定量，取50.0 μg蛋白用于凝膠電泳；待凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜后，用5%封閉液封閉1 h后加入Ⅰ抗，抗體稀釋比例如下：PCNA（1∶500）、cyclin A2（1∶500）、cyclin B1（1∶500）cyclin D1，（1∶500）、cyclin E1（1∶500）、CDK2（1∶500）、CDK4（1∶500）、CDK6（1∶500）、p21（1∶500）、E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、vimentin（1∶500）、H4（1∶800）、H4K20me1（1∶5 000）、H4K20me2（1∶2 000）、H4K20me3，（1∶1 000）、H3（1∶500）、H3K4me1（1∶1 000）、H3K4me2（1∶2 000）、H3K4me3（1∶1 000）、H3K9me1（1∶20 000）、H3K9me2（1∶1 000）、H3K9me3（1∶1 000）、H3K27me1（1∶1 000）、H3K27me2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、H3K36me1（1∶1 000）、H3K36me2（1∶10 000）、H3K36me3（1∶5 000）、H3K79me1（1∶10 000）、H3K79me2（1∶2 500）、H3K79me3（1∶1 000）、β-actin（1∶500）。條帶置于4 ℃條件下過夜孵育，TBST洗滌3遍后加入HRP標記的IgG（1∶2 000）置于搖床上室溫孵育1 h，洗滌后經ECL發光液顯影，凝膠成像分析系統掃描獲得目的蛋白條帶。實驗重復3次。

3.7基因集富集分析由于TCGA數據庫中缺乏鼻咽癌這一組織類型，本研究選取TCGA數據庫頭頸部鱗癌中患者的表達數據，使用R語言計算與所有基因的相關性，以<0.05和矯正后<0.25為閾值，使用R語言clusterprofiler包（4.1.3版本）進行基因集富集分析，包括GO（gene oncology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路，將排名前20的GO功能和KEGG信號以波浪圖展示。

4　數據學處理

采用統計軟件GraphPad Prism 8.0進行統計分析。臨床標本中SETD4蛋白表達情況的比較采用卡方檢驗。體外實驗各組數據以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用非配對檢驗，以<0.05為差異有統計學意義。基因集富集分析中應用R語言包將每個基因集的富集分數標準化，通過計算偽發現率（false discovery rate， FDR） 值來控制假陽性率，以<0.05且FDR<0.25為差異有統計學意義。

結果

1　臨床NPC組織中SETD4蛋白表達情況

對86例NPC和30例NPI組織進行免疫組化檢測，結果如圖1所示，SETD4蛋白表達為細胞核、細胞質出現陽性信號，以細胞核表達為主；臨床 NPC組織中SETD4強陽性表達率（16/86，18.6%）顯著低于NPI對照組（22/30，73.3%），差異有統計學意義（<0.01）。鑒于NPC中SEDT4蛋白表達較對照組明顯下降且總體陽性率不高，故本研究中未進一步分析SETD4蛋白與NPC患者臨床參數的相關性。

Figure 1.　The expression of SETD4 protein in clinical nasopharyngeal carcinoma and control tissues was detected by immunohistochemistry staining. A： representative cases with different levels of SETD4 protein expression ［SETD4 protein was mainly localized in the nuclei of the epithelial cells of nasopharyngeal mucosa and nasopharyngeal carcinoma tumor cells； the lower panels （scale bar=50 μm） are the magnified visual field of the boxes in the upper panels （scale bar=100 μm）］； B： number of cases with high and low expression of SETD4 protein in NPC and NPI tissues （Chi square test； data were expressed as the sample's numbers； **P<0.01）.

2　成功獲得SETD4基因敲除的NPC細胞系

應用CRISPR/Cas9技術對NPC細胞中基因進行編輯后挑選單克隆細胞進行DNA測序和半定量PCR驗證，結果顯示，成功篩選到2株基因敲除的純合子細胞（2B9和2C10），選擇其中的2B9細胞作為KO組進行后續實驗，見圖2。

Figure 2.　Construction of SETD4 gene knockout NPC cell lines using CRISPR/Cas9 technique. A： schematic diagram of targeted knockout of exon 4 of SETD4 gene and genotype identification； B： genotyping strategy and PCR product size of SETD4 knockout cell lines ［the wild type （WT， +/+）， heterozygote （+/-） and homozygote （-/-） were determined according to the size of PCR products using different primer groups］； C： agarose electrophoresis image of PCR products for genotype identification of monoclonal cell lines； D： DNA sequencing results of typical SETD4 knockout monoclonal cell lines （the number in red font indicates the length of the deleted DNA fragment of SETD4 gene in these two monoclonal cell lines）； E： semi-quantitative RT-PCR detection of SETD4 mRNA levels in SETD4 knockout monoclonal cell lines and wild-type cells （no target bands in PCR product indicates the SETD4 knockout monoclonal cells）.

3　SETD4缺失增加NPC細胞的增殖活性

CCK-8實驗結果表明，KO組細胞的增殖活性除第24 h較WT組有所減緩外，隨著培養時間的延長，KO組細胞增殖活性顯著高于WT組（<0.01）。進一步通過定量PCR檢測了細胞增殖標志物PCNA的表達，結果提示KO組PCNA mRNA水平高于WT組（<0.01）。通過Western blot檢測PCNA和細胞周期相關蛋白的表達，結果顯示KO組PCNA、cyclin D1和cyclin E1水平較WT組顯著增加（<0.05），p21水平下降（<0.05），見圖3。

Figure 3.　Knockout of SETD4 gene in NPC cells promoted cell proliferation. A： the cell proliferation in SETD4 KO group and WT group was detected by CCK-8 assay； B： quantitative RT-PCR was used to detect the level of PCNA mRNA in WT and SETD4 KO cell lines； C： the expression levels of cell cycle-associated proteins were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs WT group.

4　SETD4缺失對NPC細胞上皮-間充質轉化的影響

KO組細胞的形態較WT組出現更明顯的多角形和短梭形（圖4A）。通過Western blot檢測上皮-間充質轉化相關蛋白的表達，觀察到KO后顯著增加了N-cadherin和vimentin蛋白的表達（<0.05），顯著減少了E-cadherin蛋白的表達（<0.05）。功能上，KO細胞較WT組細胞遷移能力顯著增加（<0.01），見圖4。

Figure 4.　SETD4 gene knockout induced epithelial-mesenchymal transition in NPC cells. A： representative morphological images of WT group and SETD4 knockout group （compared with WT cells， SETD4 knockout cells showed more obviously spindle and polygonal morphology）； B： Western blot detection of protein levels of epithelial-mesenchymal transition-related markers including E-cadherin， N-cadherin and vimentin； C： representative images and quantification analysis for cell migration in WT and SETD4 knockout cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs WT group.

5　SETD4表達改變對組蛋白賴氨酸甲基化的影響

采用Western blot對常見組蛋白H3和H4的某些位點的賴氨酸甲基化水平進行了檢測，結果表明，表達缺失顯著減弱了NPC細胞中H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K27me3、H3K79me2和H4K20me2蛋白水平，而對其他位點如H3K39me1、H3K39me2、H3K39me3、H3K4me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me1、H3K39me2、H3K79me1、H3K79me3、H4K20me1和H4K20me3蛋白表達無明顯影響，見圖5。

Figure 5.　The effect of SETD4 knockout on methylation of histone lysine sites in NPC cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs WT group.

6　與SETD4關聯的功能和信號通路

與關聯的GO功能主要有DNA復制（DNA replication）、姐妹染色體分離（sister chromatid segregation）、細胞周期檢查點信號（cell cycle checkpoint signaling）、有絲分裂細胞周期（mitotic cell cycle）、有絲分裂細胞周期G2/M轉換（G2/M transition of mitotic cell cycle）和有絲分裂細胞周期G1/S轉換（G1/S transition of mitotic cell cycle）等。KEGG信號主要涉及錯配修復（mismatch repair）、細胞周期（cell cycle）、同源重組（homologous recombination）、泛素化介導的蛋白降解（ubiquitin mediated proteolysis）等，見圖6。

Figure 6.　SETD4-related GO annotations and KEGG signaling pathways in head and neck squamous cell carcinoma （HNSC）. Datasets of HSNC patients in TCGA database were selected， the correlation between SETD4 and genes were calculated using R language cluster profiler package （version 4.13）， and those genes with P<0.05 were extracted for GSEA enrichment analysis of GO annotations （A） and KEGG signaling pathways （B）， and the top 20 results based on p.adjust values and normalize enrichment scores were displayed.

討論

基因位于第21號染色體q22.12上，它編碼的SETD4蛋白為全細胞分布，以胞核和胞質為主，且SETD4蛋白在多種細胞中均有表達，因其種屬及組織來源的不同表達特征有所差別［14］，可通過調節多種基因的表達影響細胞功能并參與多種疾病的發生發展［15］。總體上，目前對基因的功能研究甚少，有研究揭示了其在鹵蟲滯育形成期間發揮著重要作用［16］。而在哺乳動物體內，研究人員觀察到通過上調炎癥細胞因子的產生，在宿主抵抗感染的先天免疫反應中發揮重要作用［17］。有關與腫瘤關系的報道不多。有報道顯示表達異常與乳腺癌有關［8-9］，最近研究表明，成年小鼠的缺失延長了輻射誘導的T淋巴瘤的生存期［18］。截止當前尚未見有關與NPC關系的研究。因此，闡明表達異常與NPC的關系，可能為基于表觀遺傳角度NPC的發病機制提供新的實驗依據。

本研究首次顯示，SETD4蛋白在臨床NPI標本中普遍呈高表達，陽性信號以胞核定位為主。相反，NPC組織中SETD4蛋白則呈低水平表達或不表達，這一結果提示NPC中SETD4蛋白表達丟失可能在NPC病理生理過程中發揮重要作用。從蛋白的表達定位來看，SETD4主要定位于胞核，這與其組蛋白甲基化調控功能所需的細胞核定位是一致的。為進一步明確在NPC中的生物學功能，應用課題組前期已經掌握的CRISPR/Cas9基因組編輯技術［19］，我們對CNE2細胞中的基因進行了敲除。CRISPR/Cas9 基因編輯系統可以靶向剪切DNA雙鏈從而獲得特定基因敲除的模式細胞或動物，也可進行基因特異位點的敲入，從而獲得特異基因過表達模式細胞或動物［20］。實驗結果證實成功獲得了基因敲除的NPC細胞，且未發現其他的脫靶效應（未發表資料），這為后續研究奠定了細胞模型基礎。

實驗從多個角度對基因敲除后的NPC細胞的增殖活性進行了探討。首先，基于CCK-8實驗檢測到敲除后有利于細胞的增殖活性增加；其次從增殖細胞的代表性標志基因的表達上看，基因敲除從轉錄和翻譯水平上均上調了mRNA和蛋白的表達；再次，考慮到細胞周期與細胞增殖的密切關系，本研究中檢測了細胞周期相關蛋白的表達，結果顯示基因敲除增加了NPC細胞中cyclinD1和cyclinE1并下調了P21蛋白的表達；因此，表達缺失可以通過調節細胞周期相關因子的表達參與細胞增殖的調控。2013年Faria等［9］首先報道在乳腺癌細胞中SETD4蛋白表達可以通過調控cyclinD1的表達而介導細胞的增殖；然而有研究指出，分化成熟的乳腺癌細胞中SETD4蛋白表達水平低，而靜止期的乳腺癌干細胞中SETD4蛋白表達水平顯著增加［8］。也有報道進一步提示，基因敲除有利于骨髓干細胞的增殖從而恢復放射損傷后的骨髓功能［21］，這些前期報道提示表達增加與干細胞的增殖活性增強有關。我們當前的研究支持表達缺失促進NPC細胞的增殖的現象，但我們猜測與NPC干細胞也存在某種聯系。因此，很可能調節細胞增殖的功能存在細胞類型或微環境的差異。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本特征［22］，而上皮-間充質轉化是上皮細胞惡性腫瘤侵襲和轉移的早期事件。本研究表明，基因敲除后賦予了NPC細胞更明顯的間充質細胞形態；從基因表達上顯示敲除有利間充質表型基因的上調表達；從功能上看，基因敲除增強了NPC的遷移能力。因此，NPC細胞中表達缺陷可能通過誘導腫瘤細胞出現上皮-間充質轉化而促進其侵襲和轉移。但相關機制目前尚不清楚，很可能組蛋白的甲基化修飾程度的差異在基因的轉錄調控上發揮了重要的作用。

組蛋白甲基轉移酶可將甲基轉移到組蛋白的賴氨酸殘基上，被添加的甲基基團主要位于H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79及H4K20上。本研究顯示，基因敲除后伴隨H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K27me3、H3K79me2和H4K20me2的表達水平的顯著下降，提示NPC中參與了H3K4、H3K9、H3K36、H3K79及H4K20等多個賴氨酸位點的甲基化修飾，而這些組蛋白賴氨酸甲基化同時涉及了單甲基化、二甲基化和三甲基化。有關SETD4調控H4K20和H3K4的甲基化程度已有報道［9， 16-17］，本研究結果提示可能參與調控除H4K20和H3K4外其他多個位點的組蛋白賴氨酸的甲基化，拓展了SETD4靶點的研究。有觀點認為，H3K27、H3K9、H4K20、H3K79和H2BK5的單甲基化都與基因激活有關，而H3K27、H3K9和H3K79的三甲基化與基因抑制有關［23-24］。因此，NPC細胞中基因敲除后對基因組表達調控非常復雜，具體基因的表達調控后期可以通過ChIP測序實驗來進行篩選。

最后，進一步采用TCGA數據庫，實驗分析了可能涉及的功能和信號通路。由于TCGA數據庫缺乏鼻咽癌這一組織類型，我們以頭頸部鱗癌為例進行了探討，結果顯示，關聯的功能大多數與細胞有絲分裂、細胞周期轉換有關，且在信號通路中也富集到細胞周期這一信號，這些結果充分提示與細胞增殖活性存在一定的關系。考慮到NPC是頭頸部鱗癌的一種特殊類型，因此我們推斷，表達異常可通過干擾細胞周期來影響NPC的增殖與活性。

總之，本研究首次觀察到，相對于良性對照組織，臨床NPC組織中SEDT4蛋白表達呈明顯的減弱或缺失狀態，而SETD4蛋白的表達不足顯著促進了NPC細胞增殖和遷移。表達不足影響NPC細胞基因表達可能與其影響多個組蛋白賴氨酸甲基化修飾有關，并可能重點影響了細胞的周期進程。后期還需要優化體外細胞學實驗和增加動物實驗來進一步驗證。

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Effect of histone methyltransferase SETD4 on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells

FENG Muyin1， ZHENG Axiu1▲， BAI Jianrong1， ZENG Yumei4， LUO Botao1， SHEN Zhihua1△， JIE Wei1，2，3△

（1，，，524023，；2，，570102，；3，571199，；4，，528400，）

To clarify the expression of histone methyltransferase SET-domain-containing protein 4 （SETD4） in clinical nasopharyngeal carcinoma （NPC） tissues， and to analyze the effect of SETD4 on the proliferation and migration of NPC cells.The protein levels of SETD4 in clinical 86 cases of NPC and 30 cases of control nasopharyngeal chronic inflammation （NPI） tissues was detected by immunohistochemistry. Thegene in CNE2 cells was knocked out based on CRISPR/Cas9 technology. The genotypes were identified by DNA sequencing and semi-quantitative RT-PCR. The morphology of cells was observed by inverted microscope， the proliferation activity of cells was analyzed by CCK-8 assay， and the changes in cell migration ability were assessed by Transwell assay. Proliferating cell nuclear antigen （PCNA），cell cycle-related proteins， markers of epithelial-mesenchymal transition and histone lysine methylationwere detected by Western blot. Finally， SETD4-associated functions and signaling pathways were enriched by bioinformatics.SETD4 protein was mainly localized in the nuclei of NPC cells， and the positive expression rate of SETD4 protein in NPC tissue was significantly lower than that in NPI control group （<0.01）. Based on CRISPR/Cas9 technology， thegene in CNE2 was successfully knocked out， and homozygous cell lines were obtained. Compared with wild type （WT） cells，knock out （KO）cells showed more obvious spindle and polygonal shapes， and the proliferation and migration ability were significantly increased （<0.01）， the expression of E-cadherin and p21 protein were significantly down-regulated （<0.05）， while cyclin D1， cyclin E1， N-cadherin， and vimentin protein expressions were significantly up-regulated （<0.05）. In addition， the levels of H3K4me2，H3K4me3， H3K9me1，H3K27me3， H3K79me2 and H4K20me2 were decreased in KO group compared with WT group （<0.05）.Gene sets enrichment results showed thatwas associated with functions and signaling pathways related to cell cycle.The expression of SETD4 in clinical NPC tissues is generally attenuated or absent. The SETD4 mainly promotes NPC cell proliferation by mediating cell cycle-related proteins， and provokes cell migration by inducing epithelial-mesenchymal transition. The SETD4mainly affects the methylation of H3K4， H3K9， H3K27， H3K79 and H4K20 in NPC cells.

nasopharyngeal carcinoma； histone methyltransferase； SET domain-containing protein 4； cell proliferation； cell migration； gene set enrichment

R363.2； R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.008

1000-4718（2023）02-0259-10

2022-07-15

2022-11-29

［基金項目］廣東省揚帆計劃高層次人才項目（No. 4YF16007G）

申志華 Tel： 0759-2388587； E-mail： szh75@126.com； 揭偉 Tel： 0898-66968217； E-mail： wei_jie@hainmc.edu.cn

▲并列共同第一作者:第一作者

（責任編輯：余小慧，李淑媛）