Sirt6通過調控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌細胞鐵死亡*

王瑤， 陳士坤， 段晨陽， 梁筱晗， 周成富， 秦珺， 侯東堯， 杜權，2△

Sirt6通過調控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌細胞鐵死亡*

王瑤1， 陳士坤1， 段晨陽1， 梁筱晗1， 周成富1， 秦珺1， 侯東堯1， 杜權1，2△

（1重慶醫科大學附屬第二醫院麻醉科，重慶 400010；2重慶市老年醫學臨床研究中心，重慶 400010）

探討骨骼肌細胞鐵死亡的發生及sirtuin 6 （Sirt6）對其調控的分子機制。將C2C12小鼠成肌細胞分為對照組、erastin（Era；鐵死亡誘導劑）組、Era+ferrostatin-1（鐵死亡拮抗劑）組、Era+MDL-800（Sirt6激動劑）組和Era+OSS-128167（Sirt6抑制劑）組；通過細胞活力和C2C12成肌細胞肌源性分化情況觀察鐵死亡誘導劑及拮抗劑的影響；RT-qPCR和Western blot測定成肌細胞及肌管中Sirt6、肌萎縮標志物、鐵死亡標志物的mRNA及蛋白表達水平；進一步檢測P53蛋白乙?；健麅葋嗚F離子（Fe2+）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）及脂質過氧化指標Liperfluo；免疫熒光法檢測肌管分化標志物肌球蛋白重鏈（MHC）熒光信號。Era降低成肌細胞活力和肌管分化質量，伴有Sirt6的mRNA和蛋白水平下降（<0.05），肌萎縮標志物肌肉環指蛋白1（MuRF1）和肌萎縮F盒蛋白（MAFbx）表達增加（<0.05）。激活Sirt6可抑制P53蛋白第381位賴氨酸乙?；档蚉53表達水平，提高溶質載體家族7成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）水平，改善ROS、GSH、Fe2+和脂質過氧化等鐵死亡特異性指標（<0.05），逆轉鐵死亡導致的肌肉負性變化。反之，抑制Sirt6將進一步加重鐵死亡。Sirt6可抑制P53蛋白乙酰化使其活性降低，通過調控P53/SLC7A11/GPX4信號通路抑制成肌細胞鐵死亡，進而改善肌肉質量。

肌肉減少癥；sirtuin 6；鐵死亡；去乙?；?/p>

隨著老齡化社會的到來，年齡相關的進行性骨骼肌變化引發的一系列負面影響越發突出。肌肉減少癥（sarcopenia；簡稱肌少癥）作為一種以骨骼肌質量降低、力量下降、功能退化為特征的全身性肌肉綜合征，是衰老的特征性表現［1-2］?；疾±夏耆后w自主活動能力下降、術后并發癥增加及住院時間延長［3］，給個人、家庭及社會帶來巨大的心理壓力和醫療經濟負擔。肌少癥雖然已經被WHO定義為一種疾病，但對它的認識還遠不清楚，值得我們進一步探索。

氧化應激、炎癥反應、肌蛋白合成與代謝失調等均被認為是肌少癥發生的原因［4-5］。骨骼肌是機體質量最大的組織，通過有氧代謝維持生命活動，其鐵元素含量豐富并隨年齡增長不斷累積［6-8］。這一特性讓鐵死亡（ferroptosis）這種鐵依賴的、胞內脂質過氧化物和活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）急劇增加為特征的全新細胞死亡方式也參與到肌少癥發生中［9-11］。鐵死亡涉及多種基因信號表達變化，腫瘤抑制因子P53不僅參與腫瘤調控，近來也被發現在鐵死亡誘導劑erastin （Era）作用后表達增強［12］，抑制下游胱氨酸/谷氨酸逆向轉運系統（System XC-）中的輕鏈亞基溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）表達和胱氨酸攝取，導致谷胱甘肽（glutathione， GSH）依賴的谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）活性降低，促進細胞膜上高表達的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，從而發生細胞鐵死亡［13-14］。

sirtuins是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）依賴性脫乙酰酶，共有7個亞型。sirtuin 6 （Sirt6）是位于細胞核中的多效賴氨酸脫乙酰酶，在能量代謝、衰老、炎癥、應激反應和癌癥等多方面發揮重要作用［15-17］。近期有研究發現Sirt6能夠調控胃癌［18］和胰腺癌［19］中的鐵死亡，但在肌少癥領域中鮮有報道。使用生物信息學分析發現P53蛋白是肌少癥和鐵死亡交叉的關鍵信號之一。P53表達受多種翻譯后修飾影響，在其C末端區域中多個賴氨酸位點受乙?；饔谜{控并提高P53穩定性［20］。Sirt6通過使P53的C末端區域關鍵乙?；稽c——第381位賴氨酸（Lys381）去乙?；?，降低P53活性，影響下游信號轉導［21］。因此，本研究假設Sirt6通過去乙?；饔媒档蚉53表達，經P53/SLC7A11/GPX4信號通路抑制肌細胞鐵死亡而改善骨骼肌質量，并進行實驗驗證。

材料與方法

1　實驗材料及主要試劑

C2C12小鼠成肌細胞系購自中國科學院上海細胞庫。C2C12專用培養液購自Procell；DMEM basic培養液和馬血清均購自Gibco；鐵死亡誘導劑Era、鐵死亡特異性拮抗劑鐵抑素1（ferrostatin-1， Fer-1）和Sirt6抑制劑OSS-128167 （OSS）均購自MedChemExpress；Sirt6激動劑MDL-800 （MDL）購自APExBIO；CCK-8試劑及抗Sirt6、肌肉環指蛋白1（muscle ring-finger protein 1， MuRF1）、SLC7A11、GPX4和GAPDH抗體均購自ABclonal；抗肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain， MHC）抗體購自Santa Cruz；抗乙酰化P53 （Lys381）蛋白［Ac-P53 （Lys381）］抗體購自Immumoway；抗肌萎縮F盒蛋白（muscle atrophy F-box protein， MAFbx）抗體購自Proteintech；快速RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒及SYBR Green PCR試劑盒均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；抗P53抗體購自Cell Signaling Technology；DCFH-DA熒光探針購自Biosharp；GSH測定試劑盒購自上海碧云天公司；胞內亞鐵離子熒光探針FerroOrange及脂質過氧化物熒光探針Liperfluo均購自Dojindo。

2　細胞培養及分組

2.1細胞培養與肌管分化C2C12小鼠成肌細胞在37 ℃、5% CO2的培養箱中使用C2C12專用培養液進行培養，細胞密度達70%～80%進行傳代或分化。分化培養液由DMEM basic培養液和2%馬血清組成，每天更換分化培養液，分化5 d形成肌管用于實驗。

2.2細胞、肌管治療及分組將Era、Fer-1、OSS和MDL溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）中，DMSO作為對照（control， Con）組。細胞和肌管用藥物處理24或48 h，Fer-1、OSS或MDL提前預處理2 h。實驗分組：Con組、Era （1 μmol/L）組、Era （1 μmol/L）+Fer-1 （1 μmol/L）組、Era （1 μmol/L）+OSS （100 μmol/L）組和Era （1 μmol/L）+MDL （5 μmol/L）組。

3　主要方法

3.1CCK-8實驗按每孔5 000個細胞種板，細胞密度達80%加藥反應不同時間。換液后每孔加入CCK-8試劑10 μL，反應0.5～4 h，使用多功能酶標儀測量450 nm波長下吸光度，用以反映細胞活力。

3.2肌源性分化形態學觀察6孔板中細胞生長密度達80%，更換含不同藥物的分化培養液，每天換液，共分化5 d。使用倒置熒光顯微鏡對肌管形態和數量進行可視化觀察。

3.3肌管免疫熒光染色成肌細胞用含有不同藥物的分化培養液處理5 d形成肌管。PBS溶液洗滌，冰甲醇固定20 min，0.5% Triton X-100冰上透膜15 min。5% BSA室溫封閉1 h。MHC抗體（1：50）4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，滴加含DAPI抗熒光淬滅劑封片。使用正置熒光顯微鏡觀察拍照，并用ImageJ軟件分析。

3.4RT-qPCR實驗使用快速RNA提取試劑盒從細胞或肌管中提取總RNA并測定濃度。再用反轉錄試劑盒去除gDNA，將RNA逆轉錄生成cDNA。最后加入SYBR Green PCR試劑，擴增反應程序為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環；95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s，1個循環。采用2-ΔΔCt法分析數據。引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

3.5蛋白印跡分析細胞或肌管藥物處理48 h后，PBS洗滌，按100∶1∶1的比例加入細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和去乙酰酶抑制劑混合物，提取總蛋白。BCA法定量蛋白濃度。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓100 V濕轉1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入抗Sirt6、P53、MAFbx、MuRF1、SLC7A11和GPX4抗體（1∶1 000），抗Ac-P53 （Lys381）抗體（1∶1 500），抗GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜；加入Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1 h。使用增強型化學發光劑顯影記錄分析。

3.6ROS熒光強度測定96孔板中細胞密度達80%左右或肌管分化5 d，藥物作用24 h。按1∶1 000稀釋DCFH-DA熒光探針，在37 ℃、5% CO2培養箱中避光孵育30 min，PBS洗滌后使用酶標儀檢測熒光信號（激發光波長：488 nm，發射光波長：524 nm）。

3.7GSH測定按說明書配制所需試劑，超聲處理收集的細胞上清液，去除內源性GSH；混勻反應試劑，室溫反應5 min；再加入50 μL NADPH溶液（0.5 g/L），室溫反應25 min，用酶標儀檢測。單點法繪制標準曲線并計算出GSH含量。

3.8胞內Fe2+測定96孔板培育細胞或肌管，密度達標后加藥處理24h。去除培養液用PBS洗滌后，每孔中加入1 μmol/L FerroOrange工作液100 μL，在37 ℃、5% CO2培養箱中避光孵育30 min。吸盡工作液后使用多功能酶標儀（激發光波長：543 nm，發射光波長：580 nm）檢測樣品熒光強度，通過相對熒光強度反映胞內Fe2+變化。

3.9胞內脂質過氧化測定96孔板中藥物處理細胞或肌管24 h。無血清培養液洗滌后，每孔中加入5 μmol/L Liperfluo工作液100 μL，在37 ℃、5% CO2培養箱中避光孵育30 min。PBS洗滌2次，使用多功能酶標儀（激發光波長：488 nm，發射光波長：545 nm）測定熒光強度。

4　統計學處理

利用GraphPad Prism 9.2軟件進行分析作圖，數值以均數±標準差（mean±SD）表示，≥3。兩組間均數比較采用檢驗；多組間均數比較使用單因素方差分析，用Tukey法進行多組間兩兩比較分析。<0.05被認為具有統計學意義。

結果

1　鐵死亡誘導劑降低成肌細胞活力及肌源性分化能力

為明確鐵死亡是否影響成肌細胞活力，并確定后續實驗藥物作用濃度，采用不同濃度（0～5 μmol/L）的Era處理C2C12成肌細胞不同時間（12、24和48 h）。結果發現，隨Era濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力顯著下降；不同濃度作用12 h細胞相對活力均大于50%；當藥物濃度大于1 μmol/L時，作用24和48 h細胞活力過低，因此選擇1 μmol/L作用48 h進行后續實驗（圖1A）。而Era引起的細胞活力降低能被鐵死亡拮抗劑Fer-1逆轉（圖1B）。

在鐵死亡對C2C12成肌細胞肌源性分化影響的研究中，細胞生長密度達到80%時更換分化培養液、含Era的分化培養液或含Era+Fer-1的分化培養液作用5 d，每天換液。顯微鏡下可見，與Con組相比，Era處理后C2C12成肌細胞數量和分化能力下降，胞核減少、肌管變短、形態異常、排列紊亂，但添加Fer-1后能部分恢復肌源性分化能力（圖1C）。

Figure 1.　Effects of erastin （Era） on C2C12 myoblasts and myotubes. A： the viability of C2C12 myoblasts treated with different concentrations of Era for 48 h； B： the viability of C2C12 myoblasts at 48 h in control （Con）， Era and Era+ferrostatin-1 （Fer-1） groups； C： the morphological changes of myoblasts differentiating into myotubes in different groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Con group； #P<0.05 vs Era group.

2　Era作用的成肌細胞和肌管中Sirt6表達下降

加入Era作用C2C12成肌細胞48 h，RT-qPCR顯示P53的mRNA表達水平升高，Sitr6及P53下游鐵死亡相關分子SLC7A11和GPX4的mRNA表達水平卻隨之降低（圖2A），且Sirt6會隨藥物作用時間延長（48 h和72 h比較）下降得愈發明顯（圖2A、B）。在蛋白層面也發現相同的變化（圖2C）。

Figure 2.　The mRNA and protein levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 in C2C12 myoblasts treated with different concentrations of erastin （Era）. A： the mRNA levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 at 48 h； B： the mRNA level of Sirt6 at 72 h； C： the protein levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 at 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control （Con） or 0 μmol/L group.

在肌管中，Era會導致肌萎縮相關分子MAFbx和MuRF1的mRNA和蛋白水平升高，同時P53的蛋白水平升高，而Sirt6的mRNA和蛋白水平及鐵死亡相關分子SLC7A11和GPX4蛋白水平下降（圖3）。

Figure 3.　Myotrophic specific E3 ubiquitin ligases were up-regulated and Sirt6 declined after erastin （Era） treatment in C2C12 myotubes. A： the mRNA expression of Sirt6， MAFbx and MuRF1 in myotubes； B： the protein expression of MAFbx， MuRF1， P53， SLC7A11， GPX4 and Sirt6 in myotubes. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control （Con） group.

以上結果表明在鐵死亡參與的肌肉病理改變中存在Sirt6的降低。Era作用使P53表達增加，可能通過影響P53/SLC7A11/GPX4鐵死亡通路的信號變化，參與肌細胞和肌管鐵死亡發生。

3　激活或抑制Sirt6對Era作用下成肌細胞活力、細胞肌源性分化和肌管的影響

3.1激活Sirt6能抑制Era引起的成肌細胞活力下降和肌管變化為探索Sirt6在鐵死亡引起的肌質量下降中是否發揮作用，在Era處理的基礎上預先加入Sirt6特異性激動劑MDL或抑制劑OSS處理成肌細胞和肌管。在成肌細胞中，MDL激動Sirt6會部分逆轉Era引起的細胞活力降低（圖4A），使P53的mRNA表達水平下降，SLC7A11和GPX4的mRNA表達水平升高（圖4B），改善脂質過氧化等鐵死亡指標（圖5），與Fer-1作用類似；OSS處理后，伴隨Sirt6表達下降，P53的mRNA表達水平升高，而SLC7A11的mRNA表達水平降低，肌細胞鐵死亡指標反映鐵死亡加重（圖4B及圖5）。以上結果進一步證實在Era誘導的鐵死亡細胞模型中，P53可抑制SLC7A11表達并出現GPX4下降，Sirt6通過P53/SLC7A11/GPX4通路抑制肌細胞鐵死亡。

Figure 4.　The cell viability （A） and the mRNA levels of ferroptosis markers （B） after adding ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL） based on erastin （Era） treatment in C2C12 myoblasts. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

Figure 5.　Lipid peroxidation indicators， Liperfluo （A）， ROS （B）， GSH （C） and FerroOrange/Fe2+（D）， in C2C12 myoblasts treated with erastin （Era）-based addition of ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

C2C12肌管用不同藥物處理48 h，RT-qPCR顯示Era使MAFbx和MuRF1的mRNA表達增加（圖6A），鐵死亡脂質過氧化指標和胞內Fe2+升高，GSH下降（圖6B）；OSS會加重鐵死亡改變，但MDL與Fer-1相似，能部分逆轉Era誘導的肌管變化（圖6）。這些結果證實鐵死亡降低肌管質量，使促肌蛋白分解分子表達增加，Sirt6的激活對此有抑制作用。

Figure 6.　Changes of amatrophy-related genes （A） and lipid peroxidation indexes （B） in C2C12 myotubes after addition ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL） based on erastin （Era） treatment. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

3.2Sirt6激活能部分恢復因Era受損的細胞肌源性分化能力使用含不同藥物的分化培養液作用細胞5 d，利用免疫熒光染色檢測肌分化末期標志分子MHC，觀察肌管分化的數量和形態。結果發現Era引起肌管胞核融合下降、數量變少、長度變短、直徑變細、排列紊亂，MHC熒光信號降低；而MDL激活Sirt6后，與Fer-1相似，能減輕上述肌管變化（圖7A），說明Sirt6能抑制鐵死亡引起的肌源性分化能力退化。

3.3Sirt6的去乙?；饔每山档蚉53表達，通過P53/SLC7A11/GPX4信號通路抑制鐵死亡肌管變化用Era處理肌管48 h，Sirt6蛋白水平下降，P53、Ac-P53 （Lys381）和肌萎縮標志蛋白（MAFbx和MuRF1）表達增強，SLC7A11和GPX4下降；在此基礎上加入MDL，則P53、Ac-P53 （Lys381）、MAFbx和MuRF1蛋白降低，SLC7A11和GPX4升高，與Fer-1相似，均能逆轉肌管鐵死亡相關蛋白表達；而加用OSS使P53、Ac-P53 （Lys381）、MAFbx和MuRF1表達進一步增加，Sirt6、SLC7A11和GPX4表達減少（圖7B）。這些結果表明，Sirt6抑制鐵死亡和改善鐵死亡相關肌管改變是通過使Ac-P53 （Lys381）去乙?；档蚉53活性，進而影響下游P53/SLC7A11/GPX4信號通路來實現的。

Figure 7.　Effects of Sirt6 on MHC and P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway in C2C12 myotubes. A： immunofluorescence staining of MHC； B： the protein levels of P53， Ac-P53 （Lys381）， SLC7A11， GPX4， MAFbx and MuRF1. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Con group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &P<0.05， &&P<0.01 vs Era+OSS group.

此外，在Era作用C2C12成肌細胞或肌管后ROS水平增高；Fer-1及MDL使ROS生成有不同程度下降；聯用OSS后ROS又進一步增加（圖5B、6B）。因此，考慮Sirt6對肌細胞和肌管鐵死亡變化的調控存在多個作用機制，除了去乙?；饔猛?，對ROS生成的影響也可能輔助抑制鐵死亡。

討論

肌少癥相關的研究已經成為老年化社會的一個重點方向，其發生機制已有大量研究報道［2， 22］，隨著對衰老研究的深入，鐵死亡與肌少癥的關聯也走進我們的視野。C2C12細胞系屬于衛星細胞（satellite cells， SCs），能夠在充分刺激下從成肌細胞轉化成可分化的肌纖維最終形成可伸縮的肌管，是用以研究肌肉分化和再生的理想體外模型。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，通過高度協調的序列程序產生成熟的骨骼肌，因此成肌細胞活力、肌源性分化能力和肌管質量下降更能從源頭反映肌肉功能、力量和質量改變［23］。本研究發現，使用Era處理后，C2C12成肌細胞發生鐵死亡，肌管分化能力下降，可對骨骼肌產生負性影響。

鐵作為人體重要的微量元素，伴隨年齡增長在身體機能調節中成為一把雙刃劍［9， 24］，讓鐵死亡從多方面對骨骼肌質量產生影響。發生鐵死亡的肌細胞中，轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1， Tfr1）明顯減少會影響SCs蛋白合成，使SCs不可逆消耗，導致肌細胞活力下降、骨骼肌再生能力變差甚至肌萎縮發生［25］。肌細胞中鐵積累增加，GPX4和核因子E2相關因子2蛋白水平降低導致細胞脂質過氧化、ROS清除障礙，加重肌細胞損傷［26-27］。P53在細胞鐵死亡中也發揮重要作用，應激條件下被大量激活，介導下游靶基因轉錄抑制，調節System XC-、GPX4促進肌細胞鐵死亡變化［12， 28-29］。此外，作為肌肉蛋白分解代謝最重要酶類，部分E3泛素連接酶參與鐵死亡發生［30］，而肌萎縮特異性E3泛素連接酶（MAFbx和MuRF1）在衰老個體骨骼肌中隨鐵累積表達增加［9， 31］。研究中也發現Era處理后MHC表達下降，MAFbx和MuRF1含量大幅升高，鐵死亡影響肌管分化，促進肌肉蛋白分解。

Sirt6是參與衰老、能量代謝、炎癥等反應的重要脫乙酰酶，缺乏的個體更容易出現體重減少、脊柱前凸、腫瘤發生率增加、加速衰老，甚至過早死亡。目前Sirt6與鐵死亡的關系多數是圍繞腫瘤相關的報道，但在非腫瘤領域中也發現Sirt6通過抑制炎癥，減少1型糖尿病小鼠前額葉皮層細胞的鐵死亡，改善1型糖尿病小鼠的抑郁和焦慮［32］。

結合P53在鐵死亡調控中的重要意義和乙?；饔媚芗訌奝53蛋白表達的特性［19， 33］，本研究針對Era處理后的C2C12成肌細胞或肌管引入Sirt6特異性激動劑MDL［34］和抑制劑OSS［35］，發現激動Sirt6能夠改善成肌細胞中鐵死亡變化并降低肌萎縮特異性E3泛素連接酶的表達。

對P53蛋白C末端第381位賴氨酸這一關鍵乙?；稽c進一步研究發現，Sirt6激活使P53中第381位賴氨酸去乙酰化導致P53活性減弱，SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表達增加，鐵死亡和肌萎縮特異性指標下降，肌源性分化能力得到一定恢復。相反，Sirt6抑制會進一步加重鐵死亡引起的變化。這些結果表明，Sirt6通過去乙酰化作用，可以影響P53/SLC7A11/GPX4信號通路表達，是鐵死亡相關肌少癥的重要調控分子。

總之，在這項研究中，我們證明了骨骼肌細胞中鐵死亡發生與P53/SLC7A11/GPX4通路中信號變化關系密切，并伴有Sirt6表達下調，肌管質量下降，最終可能導致肌少癥發生，引起肌肉功能障礙；并從機制的角度闡明Sirt6對成肌細胞和肌管鐵死亡的干預是通過促進Ac-P53 （Lys381）去乙?；?，從而影響P53/SLC7A11/GPX4信號通路實現的。我們的研究結果為鐵死亡相關肌少癥這一新型“流行病”治療提供了新的思考方向和治療策略。

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Sirtuin 6 suppresses ferroptosis in skeletal muscle cells by regulating P53/SLC7A11/GPX4 pathway

WANG Yao1， CHEN Shikun1， DUAN Chenyang1， LIANG Xiaohan1， ZHOU Chengfu1， QIN Jun1， HOU Dongyao1， DU Quan1，2△

（1，，400010，；2，400010，）

To investigate the occurrence of ferroptosis in skeletal muscle cells and its molecular mechanisms.Mouse C2C12 myoblasts were divided into control group， erastin （Era； ferroptosis inducer） group， Era+ferrostatin-1 （ferroptosis antagonist） group， Era+MDL-800 ［sirtuin 6 （Sirt6） agonist］ group， and Era+OSS-128167 （Sirt6 inhibitor） group. The mRNA and protein expression levels of Sirt6， muscle atrophy markers and ferroptosis markers in C2C12 myoblasts or myotubes were determined by RT-qPCR and Western blot. Furthermore， acetylation levels of P53 protein， intracellular ferrous ion （Fe2+）， reactive oxygen species （ROS）， glutathione （GSH） and lipid peroxidation index Liperfluo were examined. Immunofluorescence revealed the intensity of myosin heavy chain （MHC； a biomarker of myotube differentiation） fluorescence signal.Treatment with Era reduced the viability of C2C12 cells and the quality of differentiated C2C12 myotube， accompanied by decreased Sirt6 mRNA and protein levels （<0.05）. The mRNA and protein levels of muscle atrophy F-box protein （MAFbx） and muscle ring-finger protein 1 （MuRF1）， markers of amyotrophy， were increased （<0.05）. Activation of Sirt6 inhibited acetylation of lysine 381 site in P53 protein， and decreased P53 expression. The Sirt6 agonist also increased solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） expression levels， and altered ferroptosis specific indicators such as ROS， GSH， Fe2+and lipid peroxidation （<0.05）. Conversely， inhibition of Sirt6 promoted ferroptosis.Sirt6 inhibits the acetylation of P53 protein to reduce its activity， counteracts ferroptosis-associated cell death and improves muscle mass by regulating the P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

sarcopenia； sirtuin 6； ferroptosis； deacetylation

R322.7+4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.016

1000-4718（2023）02-0335-10

2022-09-19

2022-11-28

［基金項目］重慶市出國留學人員創新自主項目（No. CX2021069）；重慶科衛聯合項目（No. 2020MSXM008）

Tel： 13883643222； E-mail： duquan100@sina.com

（責任編輯：林白霜，羅森）