細胞焦亡在針刺抗腦缺血再灌注損傷中的研究進展

蔡理,姚锃鈺,楊路,許秀洪,羅夢,周國平,

(1.南方醫科大學中醫藥學院,廣州 510515;2.南方醫科大學中西醫結合醫院,廣州 510315)

腦血管病是全國第一大、全球第二大致死性疾病,其高發病率、高病死率和高致殘率使其成為目前最為威脅人類健康的疾病之一,嚴重增加社會負擔[1-2]。隨著老齡化的進展,我國缺血性腦梗死發病率也正在逐年上升[3]。大腦缺血一定時間后血液再次恢復供應,其功能不僅未能恢復,反而出現了更加嚴重的腦功能障礙,稱為腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion, CIR)損傷[4]。CIR后神經元損傷是由多種機制參與的一種復雜的病理生理過程,多種環節因素之間又互相作用。細胞焦亡是近年來發現并證實的程序性細胞死亡方式,其發生伴隨炎癥反應,是CIR后神經元損傷的重要形式之一[5]。減輕細胞焦亡及炎癥反應的發生有助于 CIR后大腦損害,是卒中防治機理研究的熱點[6]。針刺是臨床治療缺血性卒中的有效方法,大量研究表明,針刺能改善 CIR損傷,減少神經元死亡[7]。為了進一步闡明針刺治療腦缺血中風病的機理,為臨床治療提供思路,本文就近年來針刺抗卒中病涉及細胞焦亡及相關標志物的研究作一綜述。

1 細胞焦亡概述

細胞焦亡被描述最早可追溯到 198 6年,Friendlnnder等發現炭疽致死性毒素可使小鼠巨噬細胞死亡,并伴隨胞內物質快速釋放,但這種不同于凋亡的細胞死亡方式并未引起當時學界的重視[8]。直至2001年, GALLUZZI L等[9]發現細菌感染的巨噬細胞經歷了依賴半胱氨酸天冬酶-1(Caspase-1)活性的快速裂解細胞死亡后,細胞焦亡一詞才被正式定義。細胞焦亡的形態學特征、發生及調控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式。研究表明,焦亡細胞在形態上同時具有凋亡和壞死的特征,其形態學特征為核碎裂、核溶解;細胞膜滲透性增高,細胞腫脹破裂,引起胞內物質和促炎因子釋放,如白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)等,誘發炎癥反應[10-11]。進一步的研究發現細胞發生焦亡時,細胞膜有1～2 nm的小孔形成,正是這些小孔使細胞內的離子平衡喪失,水分內流,細胞腫脹繼而膜破裂,細胞發生滲透性溶解[11]。

上述細胞焦亡的形態學特征是由Caspase-1介導產生的,內源性和外源性的刺激信號通過不同途徑激活 Caspase-1,Caspase-1繼而將無活性的 IL-1β、IL-18前體裂解為具有活性的炎癥細胞因子,激活其他免疫細胞,誘導其他炎癥細胞因子、趨化因子、黏附分子等的合成,放大局部和全身炎癥反應,形成“級聯效應”[12-13]。因此,Caspase-1對細胞焦亡的形成起決定性作用,已證實在大鼠短暫性腦缺血后,皮質及海馬CA1區錐體神經元IL-1β在缺血3 h表達最顯著,且動態變化與腦水腫變化時間一致,應用 Caspase-1抑制劑YVAD-CMK可顯著減少腦組織IL-1β的含量,減輕腦水腫,改善缺血性腦損傷[14]。炎癥小體(inflammasome)是一種多蛋白質復合物,它的組裝可以導致Caspase-1被激活。在識別外源性或內源性病原相關分子后,Nod樣受體家族(Nod-like receptor, NLRs)部分成員發生自身寡聚化,在接頭蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的銜接下與 Pro-Caspase-1連接形成活化的小體,從而把無活性的 Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1[15-16]。其中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)是NLR蛋白家族中細胞焦亡中的主要炎性復合物,可對多種刺激進行應答,具有整合多種類型的危險信號從而使 Caspase-1活化的能力,是腦缺血后中樞神經系統無菌性炎癥反應的始動因子,在中樞神經系統中誘導細胞焦亡和炎癥反應[17]。除上述途徑,還有一類為依賴Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的非經典途徑。在革蘭氏陰性菌等信號刺激下,活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11切割gasdermin D(GSDMD),誘導細胞膜穿孔破裂,釋放內容物并引起炎癥反應[18]。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應,在拮抗感染和內源危險信號中起著關鍵作用。大量研究[19-21]表明,Caspase-1廣泛參與了感染性疾病、神經系統疾病、動脈粥樣硬化性等疾病的發生發展,并在其中發揮了重要作用。

2 細胞焦亡與CIR損傷

CIR損傷的病理生理過程非常復雜,目前的研究主要認為涉及該過程的機制主要有自由基損傷、炎癥反應、線粒體功能障礙、細胞自噬、鈣超載等[22]。炎癥反應的發生貫穿 CIR的整個過程,動物實驗證實發生CIR的腦組織中IL-1β、IL-6等炎癥因子呈高表達,對神經元的損傷起到重要的作用[23]。腦缺血發生的早期,缺血區腦血流速度減慢,中性粒細胞黏附至血管內皮細胞啟動炎癥反應,血流恢復供應后,外源性炎性細胞透過血腦屏障到達腦缺血區,形成繼發性低灌注,大量氧自由基開始釋放;另一方面,中樞神經系統中的星形膠質細胞誘導小膠質細胞活化、增殖,產生大量炎癥介質,增加興奮性氨基酸毒性,進一步釋放氧自由基[24-25]。在這些內源/外源性刺激下,多個炎癥信號轉導通路被激活,促使NLRP1、NLRP3等寡聚化,通過接頭蛋白ASC與相關受體結合并招募Pro-Caspase-1從而形成炎癥小體,而 Caspase-1前體又能被炎癥小體裂解,使其變成活化的 Caspase-1最終誘導細胞發生焦亡,同時放大炎癥反應,加重腦缺血再灌注損傷[26]。

此外,有研究表明,CIR發生時線粒體的過度分裂將導致自身功能發生障礙,異常線粒體與氧化酶結合產生大量氧自由基,激活NLRP3等炎性小體,并為炎性復合體的組裝提供平臺,從而激活 Caspase-1并誘導細胞焦亡的發生[27]。而在腦缺血再灌注的中晚期,大量細胞自噬性死亡,細胞內容物釋放并激活 NLRP3等炎性小體,也能誘導周邊細胞發生壞死或焦亡[28]。總之,作為伴隨炎癥反應而產生的細胞焦亡在CIR的病理生理過程中發揮重要作用,并與其他機制密切相關,腦缺血后 NLRP3、ASC及 Caspase-1等蛋白表達均有所升高,IL-1β、IL-18等炎癥因子呈高表達,而敲除NLRP3基因或使用Caspase-1抑制劑可顯著減少神經元死亡,改善缺血再灌注損傷[29-30]。

3 細胞焦亡在針刺抗CIR損傷中的研究

臨床上針灸治療中風病具有良好的效果,閆志剛等[31]對靳三針治療中風后痙攣性偏癱進行研究,發現針刺能提高中風后運動功能與日常生活活動能力,康復訓練的基礎上配合針刺治療能進一步提高偏癱患者肢體恢復能力;楚佳梅等[32]證實電針刺激腦平衡區對提高偏癱患者站立平衡功能、改善其步行能力有較好的幫助。劉憲印[33]對頭三針聯合體針治療缺血性卒中后認知障礙進行研究,結果表明針刺促進了中樞膽堿能神經系統中乙酰膽堿的分泌和合成,從而改善患者的認知功能和記憶功能。此外,針灸對改善中風病患者吞咽障礙、睡眠障礙、抑郁等諸癥都有較好的療效[34-35]。大量基礎研究也顯示針刺干預能顯著改善CIR后的神經功能缺損癥狀,降低腦梗死面積,減少神經細胞死亡等,其中關于抗神經元損傷的研究主要集中在細胞凋亡、自噬及壞死[36-37],但對細胞焦亡這一近年新發現并證實的細胞死亡方式的研究報道尚少。

3.1 針刺抗CIR損傷后伴隨炎癥反應的相關研究

細胞焦亡的發生伴隨炎癥反應,而炎癥反應是腦缺血損傷的重要機制。大量研究顯示針刺抗CIR后損傷大的作用機制和減輕炎癥損傷有關,其中也包括針刺對 NLRP3等炎性小體和IL-1β、IL-18等炎癥因子的調控作用。張亞敏等[38]發現,針刺百會和足三里可下調大鼠外周血清IL-1β和IL-6的表達,以24～48 h最顯著,提示針刺可抑制腦缺血損傷早期炎癥反應并延緩組織損傷。卞煒等[39]發現電針百會、合谷和太沖可抑制大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠皮質區嘌呤能受體P2X7R(purinergic 2X7 receptor,P2X7R)/NLRP3表達,減少小膠質細胞數量,并下調IL-1β、IL-18等炎癥因子含量從而減輕腦缺血再灌注損傷。ZHANG T等[40]研究顯示針刺能抑制卒中各時期炎癥小體NLRP3和ASC的表達及相關炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放,減輕腦組織水腫和神經性炎癥,發揮腦保護作用。此外,針刺可能對不同炎癥因子存在雙向調控,方晨晨等[41]研究發現,電針可以通過增加IL-4表達量,降低TNF-α表達量,提升 IL-4/TNF-α的比值從而發揮抗炎作用,抑制缺血再灌注區的炎癥反應,減小腦梗死體積并促進神經功能恢復。上述研究證明針刺可減輕腦缺血后的炎癥反應,同時對誘導細胞發生焦亡的炎癥小體和級聯效應下游的炎癥因子具有調控作用,為針刺抗細胞焦亡的可能性提供了理論依據,但遺憾的是并未對細胞焦亡這一細胞死亡方式做過多探究。

3.2 針刺抗 CIR損傷后神經細胞焦亡調控因子的相關研究

Caspase家族是細胞焦亡的關鍵調控基因,通過敲除Caspase-1基因或使用Caspase-1抑制劑能有效降低細胞焦亡,減輕卒中損傷,故Caspase-1在實驗研究中常被作為細胞發生焦亡的標記物[42-43]。最新的研究顯示,針刺可直接對 Caspase-1等細胞焦亡調控因子進行調控,減少神經細胞焦亡發生從而改善 CIR損傷。許秀洪等[44]發現,電針足三里、三陰交、尺澤和合谷可下調MACO大鼠海馬區Caspase-1的mRNA及蛋白水平,改善CIR損傷,HE染色顯示電針干預后發生焦亡的細胞數量減少。董苗苗等[45]發現電針可減少 MACO大鼠神經元和小膠質細胞死亡,并下調 Caspase-1、IL-1β、IL-18及 TNF-α表達,電鏡下觀察到海馬區神經細胞發生焦亡減少。劉昱麟等[46]則通過眼針干預CIRI大鼠,發現其能夠抑制缺血半暗帶區 IL-1β、IL-18及 P2X7R、NLRP3、Pro-Caspase-1、ASC、Caspase-1的表達,減少細胞焦亡的發生并發揮抗炎作用。上述研究均提示,針刺改善CIR后神經細胞焦亡的機制可能是通過細胞焦亡產生的經典途徑,即對NLRP3/Caspase-1的調控。但對于依賴 Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11誘導細胞發生焦亡的非經典途徑,或下游執行蛋白 GSDMD等針刺干預可能存在的調控機制,相關的研究報道尚少。

此外,細胞焦亡作為一種促炎性的細胞死亡方式,在多種疾病的發生發展過程廣泛參與,其他研究者的發現中,也指出了針刺療法對細胞焦亡存在的抑制作用。李曉寧等[47]通過夾脊電針干預急性脊髓損傷模型大鼠,發現夾脊電針能夠使大鼠脊髓組織NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1表達下降,且在術后3、7 d兩個時間點最顯著,提示夾脊電針可能發揮了抑制 NLRP3炎癥小體過度活化,降低Caspase-1表達,減緩細胞焦亡的作用。李海波等[48]采用電針刺激急性腎損傷大鼠雙側足三里和腎俞,發現其能降低腎小管上皮細胞焦亡率,下調腎皮質Caspase-1、IL-1β及其mRNA表達。ZHANG Y等[49]研究發現,持續4周的電針治療顯著改善了由慢性不可預測應激引起的抑郁樣行為,抑制了NLRP3炎性體組分表達和小膠質細胞激活標志物Iba-1的增加,并同時下調了IL-1β、TNF-α、IL-6表達。這些研究再次證實了針刺這一干預手段對細胞焦亡可能存在調控作用,且不局限于腦缺血病。

4 小結與展望

針刺是抗 CIR損傷的有效治療手段,但其具體作用機制尚未闡明。細胞焦亡這一新近發現并逐漸被學界重視的神經細胞死亡方式,其發生依賴 Caspase家族的激活并同時伴隨炎癥反應。目前的研究證實,針刺干預能下調 Caspase-1及相關炎癥因子的表達,發揮抗炎作用并改善CIR損傷,但尚不能完全揭示其機理。首先,針刺穴位的選擇未能統一,相關研究多采用百會、合谷、足三里等,或單穴位進行治療,橫向可比性較低。其次,治療窗口期是影響針刺調控CIR后細胞焦亡的關鍵,不同研究選擇進行針刺干預時間點,以及干預次數和持續時長其產生效果的差異性需進一步分析。最后要指出的是,目前研究對細胞焦亡發生的信號通路缺乏整體研究,并在細胞形態學檢測上未能予以重視,后續實驗可從這些方面進一步探索研究,以期揭示針刺的神經保護作用機制,并為臨床治療腦缺血病提供理論依據。