PRSS2重組胰蛋白酶誘導上皮間質轉化促進胰腺癌細胞轉移*

李燕，劉磊，馬宇，唐芳，劉雙鳳

610500 成都，成都醫學院 檢驗醫學院

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，生存率最高僅達9%［1］。轉移是胰腺癌高致死率，預后差的重要因素［2］。揭示胰腺癌轉移的誘因及機制對于探索胰腺癌的有效治療至關重要。大量研究證實由各種因素組成的腫瘤微環境在癌癥轉移中起著重要作 用［3-4］。胰腺癌患者常并發胰腺炎［5］而使癌細胞亦處于胰腺炎腫瘤微環境中，但胰腺炎腫瘤微環境是否會促進胰腺癌轉移尚不清楚。絲氨酸蛋白酶 2（serine protease 2，PRSS2）屬于絲氨酸蛋白酶，編碼陰離子胰蛋白酶原。PRSS2基因表達上調是胰腺炎的標志，其表達量與胰腺損傷的程度呈正相關［6］。學者研究發現PRSS2基因在胰腺導管細胞腺癌惡病質伴癌轉移的患者體內均上調［7］。PRSS2基因過表達已被證實促進胃癌遷移、侵襲并導致不良預后［8］，然而PRSS2在處于胰腺炎腫瘤微環境中的胰腺癌發生發展中的作用仍不明確。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認為是解釋腫瘤轉移的重要機制，意味著腫瘤轉移的開始［9-11］。EMT始于癌前病變并貫穿于腫瘤形成及侵襲轉移全過程［12］。EMT發生后細胞由多邊形變為梭形，上皮樣標志物上皮性鈣粘附素（E-cadherin，E-cad）表達下調及間充質樣標志物神經性鈣粘附素（N-cadherin， N-cad）表達上調是EMT發生的重要標志［13］。本研究旨在探討PRSS2重組胰蛋白酶是否誘導胰腺癌Panc-1細胞株發生EMT，促進癌細胞遷移及侵襲能力的變化，探索其與胰腺癌轉移的關系，為胰腺癌的早期干預及有效治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胰腺癌細胞株（Panc-1）為本實驗室保存；PRSS2重組胰蛋白酶購自上海雅心生物技術有限公司；E-cad抗體、N-cad 抗體購自Santa公司；二抗購自北京鼎國生物科技有限公司；細胞蛋白抽提試劑盒購自美國Amerso公司； BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自中國碧云天生物技術研究所；彩虹預染寬分子量蛋白Marker購自中國北京新拓達科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1數據庫分析利用GEPIA數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn）進入生存率分析界面，基因對話框輸入PRSS2， 顯示風險比，選擇95%置信區間，選擇月為軸單位，數據集選擇胰腺癌，選擇臨界值為4%，高于4%作為高表達隊列，低于4%作為低表達序列，最后分別選擇患者總生存期及無病生存期，輸出 結果。

1.2.2細胞培養Panc-1細胞復蘇后于10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合的DMEM高糖培養基中37℃，5% CO2進行培養，兩天換一次液，細胞長至90%融合度時傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3細胞傷口愈合實驗將Panc-1細胞接種于24孔板中，細胞長至90%融合度后，加無血清DMEM培養基培養15 h，用100 μL的槍頭在單層細胞上做“十”字形劃痕，PBS洗3次，根據前期預實驗結果分別加入400 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL 和10 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶，于培養0 h、12 h及24 h 3個時間點進行顯微鏡下采集圖像。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達將培養的Panc-1細胞分為3組，對照組（加入普通培養基）、 胰蛋白酶組（培養基中加入100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶）和胰蛋白酶抑制劑組（培養基中加入100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶+5 μg/mL胰蛋白酶抑制劑）。每組加入對應培養基培養24 h后分別用PBS洗3次，加入蛋白提取液裂解30 min后收集裂解液，離心取上清。BCA試劑盒檢測蛋白濃度。分別取對照組、胰蛋白酶組和胰蛋白酶抑制劑組各50μg蛋白樣品進行SDS-PAGE。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。根據目標蛋白分子量剪膜，將膜浸入封閉液中封閉1 h，分別將PVDF膜浸入E-cad、N-cad一抗（以1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。PBS洗3次，將PVDF膜浸入二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，洗滌后滴加ECL反應液，凝膠呈像系統中曝光采集圖像，以GAPDH為內參，檢測細胞中E-cad、N-cad蛋白表達水平。

1.2.5Transwell 遷移實驗用無血清培養基培養Panc-1細胞15 h，PBS洗3次，胰蛋白酶消化細胞后用無血清培養基將細胞重懸，細胞計數。對照組用無血清培養基將細胞數調整至1×105個/mL，接種于Transwell小室上室。胰蛋白酶組用含100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶的無血清DMEM培養基將細胞數調整至1×105個/mL接種于Transwell小室上室。對照組和胰蛋白酶組下室均加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃，5% CO2培養箱培養24 h后，4%多聚甲醛室溫固定膜15 min，0.1%的結晶紫避光染色15 min，隨機選取5個視野拍照，ImageJ 軟件計數，統計結果用細胞數代表Panc-1細胞的侵襲能力。

1.2.6Transwell侵襲實驗將Matrigel膠、無血清DMEM培養基按1∶5稀釋，每孔50 μL均勻鋪于Transwell小室上室底部，重建基底膜，37℃培養箱靜置4 ～ 6 h，后續操作同1.2.5。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩兩組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PRSS2表達與胰腺癌患者總生存期呈負相關

利用GEPIA數據庫分析PRSS2表達情況與178例胰腺癌患者生存期的關系，結果顯示高表達PRSS2的胰腺癌患者總生存期顯著低于PRSS2低表達患者，Logrank P = 0.018，P（HR） = 0.046（圖1A）； PRSS2高表達的胰腺癌患者無病生存期與PRSS2低表達患者無顯著差異，Logrank P = 0.056，P（HR） = 0.074（圖1B）。

圖1 PRSS2表達與患者預后的關系Figure 1．Relation of PRSS2 Expression to the Prognosis of Patients

2.2 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶使Panc-1細胞遷移能力加強

通過傷口愈合實驗初步分析不同濃度PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞遷移能力的影響，結果（圖2）顯示PRSS2重組胰蛋白酶濃度≥300 ng/mL 作用24 h后，貼壁生長的Panc-1細胞部分脫落；100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用24 h后，細胞遷移距離明顯大于對照組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；濃 度 在50 ng/mL以 下 的PRSS2重 組胰蛋白酶對細胞遷移能力的影響無統計學意義（P ＞ 0.05）。

圖2 不同濃度PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞遷移能力的影響Figure 2．Effects of Trypsin at Different Concentrations on Panc-1 Cell Migration

2.3 PRSS2重組胰蛋白酶誘導Panc-1細胞發生EMT

如圖3所示，對照組Panc-1細胞呈多邊形，在100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用24 h后，多數細胞變為前后極性的梭形，而胰蛋白酶抑制劑組細胞形態仍為多邊形。

圖3 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞形態的影響（×400）Figure 3. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Morphology of Panc-1 Cells (×400)

100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細胞24 h后，對照組、胰蛋白酶組及胰蛋白酶抑制劑組的E-cad相對表達量分別為1.08±0.01、0.587±0.029、1.333±0.047，胰 蛋 白 酶 組 明 顯低 于 對 照 組（t = 27.969，P ＜ 0.001），胰 蛋 白 酶 抑制 劑 組 高 于 胰 蛋 白 酶 組（t = 23.354，P ＜ 0.001），差異具有統計學意義；N-cad相對表達量分別 為0.742±0.018、1.843±0.055、0.913±0.031，胰蛋白酶組明顯高于對照組（t = 33.163，P ＜ 0.001），胰蛋白酶抑制劑組低于胰蛋白酶組（t = -25.598，P ＜ 0.001），差異有統計學意義（圖4）。

圖4 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞E-cad及N-cad蛋白表達的影響Figure 4．Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Expressions of E-cad and N-cad Proteins

2.4 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶增強Panc-1細胞遷移能力

Transwell遷移實驗證實100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細胞24 h后，對照組穿過小室細胞數為（107.2±11.009）個，胰蛋白酶組穿過小室細胞數為（806.6±20.924）個，胰蛋白酶組遷移細胞數顯著高于對照組，差異有統計學意義（t = 21.774 ，P ＜ 0.001，圖5）。

圖5 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞遷移能力的影響Figure 5. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Migration Ability of Panc-1 Cells

2.5 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶增強Panc-1細胞侵襲能力

Transwell侵襲實驗證實100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用Panc-1細胞24 h后，對照組穿過小室細胞數為（103.2±10.709）個，胰蛋白酶組穿過小室細胞數為（484.8±11.734）個，細胞侵襲個數顯著多于對照組，差異有統計學意義（t = 21.547，P ＜ 0.001，圖6）。

圖6 100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶對Panc-1細胞侵襲能力的影響Figure 6. Effects of Trypsin 100 ng/mL on the Invasion Ability of Panc-1 Cells

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，90%的患者診斷時腫瘤已擴散至胰腺以外器官，其中發生全身轉移的胰腺癌患者 ＞ 50%［14］。找到誘發腫瘤轉移的因素對于腫瘤的早期干預至關重要。胰腺癌常處于胰腺炎腫瘤微環境中，流行病學證實胰腺炎與胰腺癌關系密切。有學者研究發現769例胰腺癌患者中就有536例有急性胰腺炎病史［15］。胰腺導管細胞腺癌伴急慢性胰腺炎患者與不伴胰腺炎患者比較，胰腺癌復發較早，且急性胰腺炎的嚴重程度與胰腺癌患者的無病生存期密切相關［16］。然而胰腺炎腫瘤微環境中什么物質促進胰腺癌的發生發展目前尚不清楚。

PRSS2表達上調是胰腺炎的發生標志，Narasimhan等［7］發現PRSS2在胰腺導管細胞腺癌發生轉移及惡病質的患者體內均上調。本課題組利用GEPIA數據庫分析PRSS2基因與胰腺癌患者預后的關系，發現數據庫所收集的病例中，將患者PRSS2表達量4%作為判斷閾值，高于4%為高表達，低于4%為低表達，隨著患病時間的延長，PRSS2高表達患者總生存期顯著低于PRSS2低表達患者，PRSS2基因與胰腺癌患者預后呈明顯負相關。本課題組認為PRSS2基因可能是導致處于胰腺炎腫瘤微環境中的胰腺癌發生轉移的關鍵因素，然而該基因與胰腺癌的關系目前未見國內外有文獻報道。EMT是一個轉錄及表觀遺傳程序，上皮樣細胞通過該程序獲得間充質樣細胞特性，從而打開細胞連接，獲得更強的運動侵襲能力，離開癌癥原發灶，進而形成新的腫瘤團塊［17］。E-cad蛋白表達缺失被證實與胰腺癌疾病進展密切相關。有研究在106例胰腺導管腺癌組織中發現E-cad的表達部分缺失率為53.8%（57/106），完全缺失率為11.3%（12/106），正常組織中的缺失率為0%，差異有統計學意義（P ＜ 0.01）， E-cad表達完全缺失、部分缺失和完全表達的患者的中位總生存期分別為7個月、19個月和25個月，同時研究發現E-cad表達的缺失與腫瘤的分化程度及早期轉移相關［18］。本課題組通過實驗證實100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶作用于胰腺癌細胞24 h后，多數細胞由多邊形變為前后極性的梭形；E-cad蛋白表達顯著下調（t = 27.969，P ＜ 0.001），間充質樣標志物N-cad蛋白的表達上調（t = 33.163，P ＜ 0.001）；細胞遷移、侵襲能力增強（t = 21.774 ， P ＜ 0.001；t = 21.547，P ＜ 0.001）。綜合以上結果，本課題組認為源于PRSS2的重組胰蛋白酶濃度達100 ng/mL時能誘導Panc-1細胞發生EMT且促進癌細胞轉移、侵襲。本課題組進一步實驗發現100 ng/mL PRSS2重組胰蛋白酶中加入胰蛋白酶抑制劑后，細胞形態維持多邊形，E-cad表達明顯高于胰蛋白酶組（t = 23.354，P ＜ 0.001），N-cad表達明顯低于胰蛋白酶組（t = -25.598，P ＜ 0.001），提示胰蛋白酶抑制劑能逆轉PRSS2重組胰蛋白酶的EMT誘導現象，表明PRSS2基因所產生的胰蛋白酶是導致胰腺癌發生轉移的重要因素。然而，目前文獻中PRSS2基因與胰腺癌的關系僅限于揭示胰腺癌患者血清及組織中PRSS2基因表達增 加［19］，沒有更進一步的研究揭示PRSS2基因與胰腺癌的直接關系，本研究為處于胰腺炎微環境中的胰腺癌患者的早期干預提供了一定的理論依據。

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