HPLC-DAD法測(cè)定復(fù)方麻黃散中非法添加喹烯酮

陳錫龍，龔旭昊，孫真崢，王慶紅，謝麗麗，楊 強(qiáng)，趙 貴*

(1. 貴州省獸藥飼料檢測(cè)所，貴陽 550003：2. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

復(fù)方麻黃散臨床上主要用于治療肺熱咳喘，具有化痰止咳功能[1]。喹烯酮(quincetone)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制開發(fā)的一種新型喹噁啉類抗生素，曾經(jīng)主要作為飼料藥物添加劑被廣泛用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中。自2020年1月1日起，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廢止僅有促生長(zhǎng)用途的藥物飼料添加劑等品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，注銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)和進(jìn)口獸藥注冊(cè)證書，喹烯酮預(yù)混劑在列，標(biāo)志著喹烯酮及其預(yù)混劑被禁用[2]。現(xiàn)在復(fù)方麻黃散中發(fā)現(xiàn)違規(guī)添加喹烯酮，違反了《獸藥管理?xiàng)l例》，給動(dòng)物源性食品安全埋下隱患。同時(shí)，喹烯酮藥物殘留可能存在一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部尚未發(fā)布獸藥中非法添加喹烯酮的檢查方法，因此，急需建立相關(guān)檢查方法，為嚴(yán)查使用喹烯酮提供技術(shù)支撐。近年來，陸春波、羅成江分別開展了喹乙醇預(yù)混劑及氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加喹烯酮的研究[4-5]，中獸藥制劑中喹烯酮的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)參考《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中喹烯酮的測(cè)定方法[6]，按照非特定非法添加物質(zhì)檢查方法相關(guān)要求[7]，擬建立復(fù)方麻黃散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD檢查方法，可用于檢查復(fù)方麻黃散中非法添加喹烯酮。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器)；色譜柱為Hypersil GOLD C18(5 μm, 4.6 × 250 mm)色譜柱。XSR205DU型電子分析天平(感量0.01 mg，德國(guó)梅特勒托利多公司)；ME802E型電子分析天平(感量0.01 g，德國(guó)梅特勒托利多公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器廠)。甲醇為色譜純，水為超純水，N,N-二甲基甲酰胺為分析純。

1.2 試藥 喹烯酮對(duì)照品(含量：99.9%，批號(hào)：H0561704，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；空白制劑：自制復(fù)方麻黃散(取麻黃100 g，桔梗100 g，薄荷40 g，黃芪10 g，氯化銨100 g。前4味粉碎，過4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩，與研成細(xì)粉的氯化銨混勻，即得。所需中藥均購自正和祥藥業(yè)有限公司)；供試品：復(fù)方麻黃散(批號(hào)：20200501，經(jīng)檢測(cè)含有喹烯酮)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱為固定相；以甲醇-水(60∶40，V∶V)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30 ℃，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，采集波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，分辨率為1.0 nm；記錄波長(zhǎng)314 nm處的色譜圖，同時(shí)記錄光譜圖。

2.2 溶液配制

2.2.1 復(fù)方麻黃散制劑空白溶液 取空白制劑1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為復(fù)方麻黃散制劑空白溶液。

2.2.2 喹烯酮對(duì)照品貯備液的配制 取喹烯酮對(duì)照品約10 mg，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.2.3 喹烯酮對(duì)照品溶液的配制 精密量取喹烯酮對(duì)照品貯備液2 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的配制 取供試品1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.5 陽性添加樣品溶液的配制 取制劑空白樣品1.0 g，置20 mL量瓶中，按高(H)、中(M)、低(L)三個(gè)濃度水平分別加入10、8和6 mg喹烯酮，混勻，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為陽性添加樣品溶液。

2.2.6 檢測(cè)限溶液的配制 取制劑空白樣品1.0 g，置20 mL量瓶中，分別加入0.5 mg/mL的喹烯酮對(duì)照品貯備液0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL，混勻，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.7 建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液 以喹烯酮對(duì)照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 通過復(fù)方麻黃散制劑空白、供試品和陽性添加樣品試驗(yàn)排除制劑中的主要成分和輔料對(duì)被測(cè)物的干擾[8]。分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的復(fù)方麻黃散制劑空白溶液、2.2.4項(xiàng)下的供試品溶液和2.2.5項(xiàng)下的高濃度水平陽性添加樣品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，供試品與陽性添加樣品色譜圖中，喹烯酮峰的保留時(shí)間一致，復(fù)方麻黃散制劑空白在喹烯酮相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾峰。試驗(yàn)結(jié)果說明方法專屬性良好。

a. 復(fù)方麻黃散制劑空白 b.供試品 c. 陽性添加樣品(10 mg/g)圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of specific inspection

2.3.2 峰純度和光譜相似度檢查 通過供試品和喹烯酮對(duì)照品溶液試驗(yàn)進(jìn)行峰純度和光譜相似度檢查。分別精密量取2.2.4項(xiàng)下的供試品溶液和2.2.3項(xiàng)下的喹烯酮對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，采集3D數(shù)據(jù)，記錄光譜圖(圖2)。結(jié)果表明，峰純度分析顯示，供試品和對(duì)照品峰匹配(表示峰最大值處的光譜與前沿和拖尾上光譜的相似度)值均為1000(匹配值大于980可以基本確認(rèn)是同一組分)，說明喹烯酮峰為單一組分。經(jīng)目測(cè)比較，可知供試品和對(duì)照品光譜圖一致(最大吸收波長(zhǎng)偏差不超過2 nm)。或者，通過執(zhí)行光譜跟蹤把供試品和對(duì)照品的光譜圖與用喹烯酮對(duì)照品溶液建立的光譜庫進(jìn)行匹配，相似度閾值設(shè)為980，可知供試品和對(duì)照品與喹烯酮光譜庫的相似度分別為1000.00和999.98，即它們的紫外光譜一致。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取喹烯酮對(duì)照品貯備液適量，加甲醇制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，測(cè)定，每個(gè)濃度水平進(jìn)樣兩次。以喹烯酮峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y=1.1969X+0.055，R2=0.9999。結(jié)果表明，喹烯酮在2.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 檢測(cè)限 通過對(duì)復(fù)方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮對(duì)照品溶液考察方法的檢測(cè)限。按2.2.6項(xiàng)下配制檢測(cè)限溶液進(jìn)行測(cè)定。以光譜圖未失真的最低添加濃度作為方法的檢測(cè)限，即加入0.5 mg/mL喹烯酮對(duì)照品貯備液0.5 mL的制劑空白樣品溶液所對(duì)應(yīng)的樣品的喹烯酮添加量即為方法的檢測(cè)限，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明復(fù)方麻黃散制劑檢查喹烯酮的檢測(cè)限為0.25 g/kg。

圖3 檢測(cè)限溶液色譜圖和光譜圖Fig 3 Chromatogram and spectrum of the LOD solution

2.3.5 準(zhǔn)確度 通過對(duì)復(fù)方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮對(duì)照品進(jìn)行回收率試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度。按2.2.5項(xiàng)下每個(gè)濃度水平分別平行配制3份陽性添加樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)平行進(jìn)樣2次，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，復(fù)方麻黃散制劑空白樣品添加喹烯酮的平均回收率為101.4%，RSD=0.5%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of recovery test

2.3.6 耐用性 以高濃度水平陽性添加樣品溶液作為耐用性試驗(yàn)溶液，改變柱溫、流速、流動(dòng)相比例及更換不同品牌的色譜柱(4.6×250 mm, 5 μm)四個(gè)方面考察方法的耐用性。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)柱溫升高、流速增加、流動(dòng)相中有機(jī)相比例提高時(shí)，保留時(shí)間會(huì)提前；使用相同規(guī)格性能相近的不同品牌的色譜柱時(shí)，保留時(shí)間會(huì)發(fā)生變化。但上述情況下分離度均滿足檢測(cè)要求，說明方法耐用性良好。

2.3.7 樣品測(cè)定 按2.2.4項(xiàng)下配制供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。供試品溶液在與喹烯酮對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致處有色譜峰出現(xiàn)；峰純度分析顯示峰匹配值為1000，為單一組分。峰跟蹤顯示該色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)庫中喹烯酮色譜峰相似度為999.99；兩者紫外光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)均一致。故判定供試品中含喹烯酮，并測(cè)得其含量為9.3 g/kg。

3 討論與小結(jié)

3.1 復(fù)方麻黃散制劑非法添加喹烯酮的發(fā)現(xiàn) 在進(jìn)行獸藥非法添加物篩查時(shí)，本試驗(yàn)使用自建方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)某復(fù)方麻黃散制劑疑似添加喹烯酮，經(jīng)過復(fù)方麻黃散制劑空白試驗(yàn)及陽性添加試驗(yàn)進(jìn)一步得到確認(rèn)。

3.2 色譜條件、提取波長(zhǎng)和檢測(cè)器的選擇 本試驗(yàn)中采用的色譜條件和提取波長(zhǎng)，均參照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷喹烯酮的液相色譜含量測(cè)定方法建立，為對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。

3.3 提取條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)的提取溶劑同樣參照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷喹烯酮的液相色譜含量測(cè)定，考慮到樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，故對(duì)樣品超聲處理10 min，確保喹烯酮被充分提取。比較而言，陸春波等[4]用甲醇提取喹乙醇預(yù)混劑中的喹烯酮，方法較簡(jiǎn)單便捷；羅成江等[5]用0.3%的磷酸溶液(取磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至3.0，加乙腈 50 mL)提取氟喹諾酮類藥物粉劑中非法添加的喹烯酮等藥物，有利于分離測(cè)定氟喹諾酮及喹噁啉類藥物，有較好的適用性和針對(duì)性。

3.4 進(jìn)樣量的選擇 試驗(yàn)在不改變其他色譜條件的情況下，采用喹烯酮對(duì)照品溶液作為試驗(yàn)溶液，分別對(duì)三款不同品牌的色譜柱進(jìn)樣20、10和5 μL，結(jié)果表明，進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，色譜峰峰形變差，故選擇10 μL作為進(jìn)樣量。

建立了復(fù)方麻黃散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD檢查方法，通過專屬性、線性關(guān)系、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、耐用性考察表明可準(zhǔn)確定量，結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收光譜、峰純度分析可準(zhǔn)確定性識(shí)別。方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于檢查復(fù)方麻黃散中非法添加喹烯酮。