在晶狀體損傷誘導的視神經長時程再生過程中MMP-12的表達規律

王國棟，趙劍峰，徐星煜，向祥林，沈一葦，何子涵，劉 康，耿 宇

0 引言

視神經損傷是臨床上嚴重的致盲因素之一。雖然屬于中樞神經系統的視神經再生困難，但晶狀體損傷后能誘導受損視神經軸突出現長時程再生[1]，軸突纖維可以達下丘腦形成有效突觸連接并改善實驗動物視覺電信號傳導[2]。有研究認為，其機制可能為晶狀體蛋白誘導視神經節細胞存活并再生，也有研究認為晶狀體損傷后誘發眼部局部炎癥在視神經再生過程中起到了重要的作用[3-4]，但既往研究均不能完全解釋這種長時程視神經再生的機制[1,5]。我們采用視神經鉗夾伴晶狀體損傷誘導視神經長時程再生的動物模型，對視神經損傷區域進行轉錄組測序，篩選出差異性高表達基因，并對篩選的高表達因子進行后期分子生物學驗證。

1 材料和方法

1.1材料本課題所用的24 只實驗動物均在昆明醫科大學動物部購買[許可證號：SCXK(滇)K2019-0002]，均為SPF級SD雄性大鼠，體質量為180～200g。所有實驗動物經昆明醫科大學實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2方法將實驗動物24只分為對照組、晶狀體損傷組、視神經損傷組、晶狀體損傷聯合視神經損傷組，每組各6只大鼠。

1.2.1建立SD大鼠視神經損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，在眼球外眥部剪開外眥角，暴露部分眼眶脂肪，鈍性分離組織，盡可能暴露眼球后部的視神經，在距眼球約0.2～0.5mm處鉗夾視神經約10s，5min后檢眼鏡觀察 SD大鼠視網膜，觀察到大鼠視網膜中央動脈恢復血供[6]。外眥角手術切口涂紅霉素眼膏每日1次，預防感染，大鼠在SPF級環境下飼養。術后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯眼部感染跡象。術后用檢眼鏡檢查眼底，排除視網膜血管損傷的SD大鼠。6只大鼠均建模成功，適用于后續實驗研究。

1.2.2建立大鼠外傷性白內障模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，暴露晶狀體，在大鼠角鞏膜緣用30G胰島素針頭水平刺入眼內，將晶狀體囊膜徹底破壞，術中可見部分晶狀體皮質外溢。術后SD大鼠眼部連續涂紅霉素眼膏3d，每日1次，預防感染。術后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯感染跡象，在裂隙燈顯微鏡下可見明顯的晶狀體白色混濁，晶狀體損傷模型建模成功。6只大鼠均建模成功，適用于后續實驗研究。

1.2.3建立晶狀體損傷聯合視神經損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，按照1.2.1和1.2.2方法建立晶狀體損傷和視神經損傷模型，建模成功標準同上，6只大鼠均建模成功，適用于后續實驗研究。

1.2.4對照組6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后右眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，僅開放眼眶暴露視神經，術后處理同前。術后術眼無感染的大鼠適用于后續實驗研究。6只大鼠均納入后續實驗研究。

1.2.5轉錄組測序

1.2.5.1RNA提取鑒定和文庫制備建模成功后14d，視神經損傷組取視神經損傷區的組織為標本，對照組和晶狀體損傷組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經組織，提取總RNA后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA降解和污染情況。使用Qubit?2.0熒光光度計中的Qubit?RNA分析試劑盒、NanoPhotometer?分光光度計和生物分析儀2100系統的RNA Nano 6000 Assay Kit評估濃度、純度、完整性。

每個測序樣本的RNA總量為3μg，使用NEB Next UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?生成基因文庫測序，并將索引代碼添加到每個組別不同樣本的屬性行列中，即用聚T寡聚糖連接的磁珠從總RNA中提取mRNA。在NEBNext(5×)第一鏈合成反應緩沖液中，用二價陽離子在升溫條件下對mRNA進行裂解。使用MMuLV逆轉錄酶和隨機六聚體引物合成第一鏈cDNA。使用RNA酶H和DNA聚合酶I進行第二鏈cDNA的合成，剩余的突出物通過核酸外切酶/聚合酶的活性轉化為鈍端。DNA片段3'端腺基化后，連接具有發夾環結構的NEBNext接頭，從而為下一步雜交鋪墊。應用AMPure XP系統對基因文庫片段進行過濾篩選，選出長度為250～300bp的cDNA片段。然后，使用3μL的USER酶與大小選擇、接頭連接的cDNA在37℃下反應15min，然后在95℃下反應5min，最后行PCR。使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶、Index引物和通用PCR引物進行PCR擴增，再用AMPure XP系統對PCR產物進行提純。

基因文庫建成后，用Qubit2熒光光度計對其初次定量，并將文庫濃度調整為1.5ng/μL，用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫的插入規格。待插入片段大小與符合預期時，采用qRT-PCR準確定量文庫的有效濃度。為確保基因文庫質量其有效濃度須大于2nmol/L。

應用TruSeq PE Cluster Kit v3-CBOT-HS在CBOT群集生成系統上對編碼樣本的群集進行索引。最后，生成簇后，在Illumina NovaSeqTM平臺上對文庫制備進行測序，并產生125bp/150bp的成對末端閱讀。

1.2.5.2有參轉錄組差異基因表達分析采用有參轉錄組無生物學重復模式，使用Edger程序包對于每個測序文庫，通過一個標度歸一化因子來調整讀取計數，再進行差異表達分析。使用Edger軟件包對兩種條件進行差異表達分析。用Benjamini&Hochberg法調整P值。以校正P值為0.05，折疊式變化絕對值[log2(FoldChange)]為2作為差異表達的閾值。分析將所有差異表達的基因映射到GO數據庫中的每一項，計算每一項中的基因數量，篩選差異表達明顯富集的基因。

1.2.6qRT-PCR實驗

1.2.6.1總RNA提取建模成功后7、14、21、28d，過量麻醉處死SD大鼠，視神經損傷組取損傷區視神經組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經組織，每取0.1g加入1500μL Trizol溶液，放入去酶EP管中。采用Trizol法提取視神經總RNA。采用U-3010微量分光光度計(日本)進行總RNA定量。

1.2.6.2引物合成采用premier5.0進行特異性引物設計，經NCBIBlast基因庫驗證引物特異性，由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6.3mRNA擴增逆轉錄反應按照PrimeScriptRTEnzymeMixI(TAKARA)試劑盒說明書進行操作，構建20μL反應體系，反應條件如下：(1)37℃，15min；(2)85℃，5s；(3)4℃保存。qRT-PCR按照TBGreenPremixExTaqII(TAKARA)試劑盒說明書進行操作，構建20μL擴增體系，反應條件如下：95℃(30s)→[95℃(5s)→60℃(34s)→95℃(15s)]×40→60℃(1min)→95℃(15s)。

1.2.7ELISA 視神經損傷組取損傷區視神經組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經組織稱重，加入9倍重量的PBS溶液，勻漿后，用5000r/min離心10min，取上清液。用稀釋液1∶4稀釋上清液(均用復孔檢測)后加入50μL至微孔內，同時設置MMP-12梯度濃度標準品作為對照；將辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體(100μL)加入微孔內，37℃溫箱進行孵育60min。孵育完成后反復沖洗96孔板5次，加入底物A及底物B各50μL，然后37℃避光孵育15min。最后，每孔加終止液50μL，15min內在450nm波長下讀取吸光度值，通過用標準品吸光度值繪制標準曲線，從而計算出各樣本濃度。

統計學分析：采用SPSS 11.0軟件進行分析，多組數據比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane’sT2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1有參轉錄組測序結果

2.1.1不同組別的主成因分析對照組和視神經損傷組數據聚集(綠色線框)，其第一主成因(PC1)和第二主成因(PC2)基本重合。晶狀體損傷聯合視神經損傷組的PC1為 94.83%(藍色線框)，在成因分析中所占比例最大，是基因表達變化中的主要因素；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%(藍色線框)，為次要因素(圖1)。

圖1 不同組別的主成因分析 綠色線框：對照組和視神經損傷組數據聚集；藍色線框：晶狀體損傷聯合視神經損傷組的PC1方差為 94.83%；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%。

2.1.2不同組間基因表達差異分析視神經損傷組和對照組比較，差異基因數最少，為164個基因。晶狀體損傷聯合視神經損傷組和視神經損傷組比較，差異基因數最多，為3396個(表2)。晶狀體損傷聯合視神經損傷組和對照組比較時，MMP-12(基因ID：ENSRNOG00000030187)在晶狀體損傷聯合視神經損傷組清理數據為1680.95，對照組的清理數據為1.00。定量分析比較兩組間差異的倍數變化為10.55。晶狀體損傷聯合視神經損傷組的MMP-12的log2(FoldChange)值較高，基因表達上調10倍以上，對照組無明顯上調。伴有晶狀體損傷的各組中，均存在MMP-12基因表達上調。

表2 不同組間差異基因的數量

2.2不同時間各組間MMP-12的mRNA表達量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異無統計學意義(F=1.453，P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異有統計學意義(F=41.476，P<0.01)；晶狀體損傷聯合視神經損傷組與對照組、視神經損傷組和晶狀體損傷組比較，MMP-12 mRNA顯著上調，差異均有統計學意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異有統計學意義(F=103.843，P<0.01)；與對照組、視神經損傷組和晶狀體損傷組比較，晶狀體聯合視神經損傷組MMP-12 mRNA顯著上調，差異均有統計學意義(P<0.01)；晶狀體損傷組與視神經損傷組比較差異有統計學意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達量比較，差異無統計學意義(F=1.266，P>0.05)，見圖2。

圖2 不同時間各組間MMP-12 的mRNA表達量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；bP<0.01 vs 晶狀體損傷聯合視神經損傷組;cP<0.05 vs晶狀體損傷組。

2.3不同時間各組間MMP-12蛋白表達量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統計學意義(F=4.199，P<0.05)。晶狀體損傷聯合視神經損傷組與對照組和視神經損傷組比較，MMP-12蛋白顯著上調，差異均有統計學意義(P<0.01)，與晶狀體損傷組比較上調，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統計學意義(F=8.143，P<0.01)；晶狀體損傷聯合視神經損傷組與對照組和視神經損傷組比較，MMP-12蛋白表達顯著上調，差異均有統計學意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異有統計學意義(F=3.124，P<0.05)。晶狀體損傷聯合視神經損傷組MMP-12 蛋白表達與對照組比較顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01)，與視神經損傷組比較上調，差異有統計學意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12蛋白表達量比較，差異無統計學意義(F=0.244，P>0.05)，見圖3。

圖3 不同時間各組間MMP-12蛋白表達量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；aP<0.05,bP<0.01 vs晶狀體損傷聯合視神經損傷組。

3 討論

成年期哺乳動物視神經受損后再生困難[7-8]，是長期以來亟待解決的臨床難題[9-10]。既往研究提示，視神經損傷后軸突能夠在移植的外周神經中再生[11]，提示視神經有內在的生長活性。一般情況下，鉗壓受損的視神經再生不超過2wk[12]，再生的軸突短，甚至不到幾毫米，不能恢復視功能[13]。在視神經受到擠壓性損傷同時伴有晶狀體損傷時，則會誘導受損的視神經軸突發生長時程再生，這種再生現象可以持續達1mo，且再生纖維可以達下丘腦(下級神經元所在區域)形成有效的突觸連接，實驗動物的視覺電生理有明顯改善[1-2]。在研究這種長時程再生的機制時，視神經損傷區域和損傷的晶狀體中均未發現有腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經營養因子-4(neurotrophin-4，NT-4)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)及堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等神經營養因子的表達；使用這些細胞因子相應的受體阻制劑也不能影響視神經節細胞的再生過程[2]，提示神經營養因子不是促進長時程再生的關鍵因子。

本實驗轉錄組測序中，主成因分析顯示：對照組和視神經損傷組數據聚集，而晶狀體損傷聯合視神經損傷組數據與它們離散，說明晶狀體損傷聯合視神經損傷大鼠模型具有不同于其它各組的基因差異表達模式，且晶狀體損傷聯合視神經損傷組的PC1為 94.83%，在成因分析中所占比例最大，是基因表達變化中的主要因素。晶狀體損傷聯合視神經損傷組，高表達的差異基因主要富集在細胞因子反應、白細胞淋巴細胞和正向免疫系統調節過程，這說明炎癥反應可能參與了晶狀體損傷誘導視神經損傷長時程再生過程。既往研究也發現炎癥反應有促進視神經再生的作用[14]，與我們的結論一致。

MMP-12在生理狀態下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合[15]，在病理狀態下參與組織重構、風濕性關節炎、惡性腫瘤轉移、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的病理進程[16-17]；MMP-12能降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)及血管壁成分，從而促進腫瘤細胞的侵襲及轉移，而且MMP-12還能激活其它MMPs從而促進水解過程[18]；MMP-12具有促髓鞘再生作用，它能誘導胰島素樣生長因子1/胰島素樣生長因子結合蛋白6復合體中釋放具有活性的胰島素樣生長因子從而促進髓鞘形成并成熟[19]，MMP-12基因敲除小鼠表現出少突膠質細胞成熟和髓鞘形成延遲，降低小膠質細胞遷移活性并促進它的成熟，可以減緩星形膠質細胞病，有利于軸突再生[20]。有研究也發現在NgR基因敲除的大鼠若同時存在眼內炎癥，視神經軸突再生會增強[21-22]；而炎癥浸潤細胞，如：巨噬細胞和中性粒細胞，是在炎癥促進視神經再生過程中起到調控作用的主體[23-24]。

我們結合轉錄組測序結果，對晶狀體損傷聯合視神經損傷的SD大鼠視神經損傷區域組織進行qRT-PCR實驗，檢測MMP-12 mRNA的表達變化。晶狀體損傷聯合視神經損傷組的MMP-12 mRNA，在14、21d時表達顯著上調，而在7、28d時，無升高。ELISA結果提示晶狀體損傷聯合視神經損傷組在第7、14、21d時，MMP-12的蛋白質表達顯著升高，但在28d時，各組間表達無差異。提示晶狀體損傷聯合視神經損傷后的視神經長時程再生伴隨有MMP-12的表達上調。既往研究提示MMP-12和MMP-9表達有促進視神經損傷的再生作用[25]，未有文獻報道MMP-12在視神經長時程再生過程中的表達規律。

因此，我們認為MMP-12的表達上調可能參與晶狀體損傷誘導視神經鉗夾損傷后軸突長時程再生過程，但MMP-12發揮促軸突再生可能是綜合作用的結果，其機制需要進一步研究探討。