軟骨母細胞瘤中 H 3.3組蛋白基因突變檢測及其臨床意義△

羅威，董金波，古家美，王芳，吳小延#

中山大學腫瘤防治中心1影像科，2分子診斷科，廣州 510060

軟骨母細胞瘤（chondroblastoma，CB）是一種罕見的良性軟骨瘤，約占所有骨腫瘤的1%，通常累及長骨的骨骺，多見于20～30歲的患者，多發生于骨骼未成熟患者的骨骺處，男性多見[1-2]。CB并不經常導致患者死亡，但CB與其他骨腫瘤具有重疊特征，例如軟骨黏液樣纖維瘤（chondromyxoid fibroma，CMF）和骨巨細胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB），導致有時難以診斷CB[3]。以往的研究發現，95%的CB在H3組蛋白成員H3.3組蛋白A（H3.3 histone A，H3F3A）（1號染色體）和H3.3組蛋白B（H3.3 histone B，H3F3B）（17號染色體）中存在p.K36M突變，其中大多數涉及H3F3B[4]。在CB中，組蛋白H3.3的36位賴氨酸至甲硫氨酸（H3K36M）突變蛋白與組蛋白H3.3的36位賴氨酸（H3K36）的SET結構域2，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（SET domain containing 2,histone lysine methyltransferase，SETD2）緊密結合，競爭性抑制它們與共同表達的野生型H3組蛋白結合，從而導致H3K36甲基化異常[5-6]。CB的產生與H3組蛋白第36位賴氨酸甲基化（H3K36me）突變過程有關[5,7]。H3K36me是一種參與表觀遺傳調控的組蛋白修飾蛋白，在DNA復制、轉錄、重組和DNA損傷修復[8]等生物學過程中發揮重要作用。突變的組蛋白H3K36多肽或核小體可顯著下調組蛋白H3K36甲基轉移酶SETD2的活性，重組H3K36me甲基化情況，并通過改變腫瘤相關基因[6,9]的表達來促進CB的發生。因此，H3.3組蛋白（H3.3 histone，H3F3）基因中的K36M位點是診斷CB靈敏度和特異度均較好的標志物[10]。本研究通過檢測CB和其他骨腫瘤中H3F3基因突變狀態，分析H3F3基因突變與CB臨床特征的關系，為深入探討H3F3基因在CB發病機制中的作用提供理論基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年5月至2022年8月中山大學腫瘤防治中心分子診斷科存檔的CB患者的病歷資料。納入標準：①有基本的臨床資料；②經手術組織病理學明確診斷為CB。排除標準：①骨腫瘤類型不明確；②臨床資料不完整。根據納入、排除標準，共納入31例CB患者，其中，男性20例，女性11例；年齡11～36歲，平均（19.5±7.4）歲；股骨為最常見的發病部位，其次為肱骨。另選取24例GCTB、7例動脈瘤樣骨囊腫、1例非骨化性纖維瘤、9例軟骨源性腫瘤（1例CMF、1例內生性軟骨瘤、5例間葉性軟骨肉瘤、1例透明細胞軟骨肉瘤、1例繼發性軟骨肉瘤）、9例骨肉瘤（8例普通型骨肉瘤及1例低級別骨肉瘤）患者的腫瘤組織。所有腫瘤組織均采用中性緩沖甲醛溶液固定，常規石蠟包埋。由3位病理科醫師檢查每個腫瘤組織的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色的載玻片，并從中選擇合適的石蠟塊用于Sanger測序。

1.2 檢測方法

1.2.1 試劑與儀器核酸提取試劑盒購自基因科技股份有限公司，通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。NanoDrop1000超微量分光光度計購自美國Nanodrop公司，ABI 3500XL聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2.2 HE染色將3 μm厚的組織切片置于載玻片上，在4%多聚甲醛中浸泡4 h，然后轉移至70%乙醇中。將切片放入處理盒中，通過一系列乙醇梯度脫水，并嵌入石蠟塊中。染色前，切片在二甲苯中脫蠟，通過降低乙醇濃度再水化，并在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）中洗滌，然后用HE染色。染色后，切片通過增加濃度的乙醇和二甲苯脫水。

1.2.3 測定DNA濃度和純度甲醛固定石蠟包埋組織，采用核酸提取試劑盒提取組織樣本DNA。病理科醫師根據HE染色選取＞50%的腫瘤組織蠟塊，3 μm厚連續切片10張，用石蠟貼片機貼于載玻片上，二甲苯脫蠟后嚴格按照試劑盒說明書進行操作，提取完畢后使用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度。

1.2.4 Sanger測序法使用PCR儀擴增H3F3B及H3F3A的36號密碼子目的片段，引物由上海生工生物公司合成，H3F3A上游引物序列為5'-GGCTCGTACAAAGCAGAC-3'，下游引物序列為5'-CAGTACATTTATTTAAGCAGTAG-3'，長度為277 bp。H3F3B上游引物序列為5'-CACGAAAGCCGCCAGGAA-3'，下游引物序列為5'-CAGCGAGCAGGGGAGGAGT-3'，長度為 143 bp。PCR 反應體系為 2×Premix EX TapTM12.5 μl，上、下游引物（10 μmmol/L）各 1.0 μl，DNA 模板 5.0 μl，去離子水5.5 μl，總體系 25.0 μl。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環10次；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次；72℃延伸5 min，12℃保溫。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用通用型DNA純化回收試劑盒回收。使用ABI 3500XL型測序分析儀進行雙向測序，使用Chromas軟件與基因組DNA序列進行比對。根據堿基信號峰圖判定是否存在突變。

1.3 統計學方法

采用R語言進行統計分析。不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用非參數秩和檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CB和其他骨腫瘤中 H3F3基因測序結果

基因突變分析顯示，31例CB中H3F3基因突變陽性率為80.6%，其中H3F3BK36M突變24例，H3F3AK36M突變1例（圖1），而其他骨腫瘤中均未發現H3F3基因突變。

圖1 CB病例基因突變的Sanger測序分析

2.2 H3F3基因突變與CB臨床特征的關系

不同H3F3基因突變狀態的CB患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同 H 3 F 3基因突變狀態CB患者臨床特征的比較

3 討論

CB作為一種良性軟骨瘤，由于與其他骨腫瘤的特征重疊，有時難以確診。在形態學基礎上通過有限的穿刺活檢區分這些腫瘤類型特別困難，因此分子檢測（或免疫組化）對于鑒別診斷至關重要。CB在第4版世界衛生組織分類中被歸類為具有中等生物學潛力的腫瘤[11]，而在第5版中被重新歸類為良性腫瘤[12]。Behjati等[7]的研究顯示，組蛋白H3K36M和H3G34W的突變分別是CB和GCTB產生的驅動突變。本研究通過DNA測序分析顯示，25例CB都具有這種精確的遺傳改變，顯示出這種突變的獨特性。此外，通過DNA測序分析評估的其他6例CB和50例其他類型骨腫瘤均未顯示突變。

本研究發現，31例CB中有80.6%的病例出現H3F3基因突變，以H3F3BK36M突變為主，其他骨腫瘤中均無突變，表明這種H3F3K36M基因突變對CB具有獨特性，并且根據之前的研究顯示，有96%的CB具有p.K36M突變[11]，因此該突變檢測方法代表了一種有價值的工具，該基因突變可用于區分CB和其他原發性骨腫瘤。此外，由于只有約4%的CB不存在H3F3p.K36M突變，因此未能檢測到突變時應該考慮其他組織類型，并且要謹慎診斷CB。

除CB外，透明細胞軟骨肉瘤是唯一檢測到p.K36M突變的軟組織腫瘤，它是一種惡性骨腫瘤，僅占所有軟骨肉瘤的2%[11]。透明細胞軟骨肉瘤與CB有許多重疊的臨床特征和放射學特征，包括腫瘤發病部位，但透明細胞軟骨肉瘤需要整體切除，而CB通常是刮除術。透明細胞軟骨肉瘤最常見于30～40歲患者的股骨近端和肱骨，而CB最常見于20～30歲患者的股骨遠端和脛骨近端。然而，兩者都可以出現在年齡＞40歲的患者中，并且可以出現在身體的任何骨骼中。在影像學特征中，透明細胞軟骨肉瘤很難與CB區分，因為兩種腫瘤類型在MRI上的信號強度非常不均勻。盡管與CB相比，透明細胞軟骨肉瘤通常較大，瘤周水腫和關節滑膜炎不太明顯，但這些標準不足以區分這兩種腫瘤[13]。本研究中并未發現透明細胞軟骨肉瘤有p.K36M突變的情況，或許需要更多的實驗數據來證實。

CB偶爾可以與傳統的中央/表面軟骨腫瘤、間充質軟骨肉瘤共享形態學表現。然而本研究顯示，在這些腫瘤中未顯示有H3F3K36M基因突變的情況，證明了該標志物的獨特價值。區分CB和軟骨母細胞骨肉瘤可能具有挑戰性，不僅因為形態重疊，而且在極少數情況下，CB會轉移到肺部。這種病變可以通過從肺部切除來控制，而不會導致疾病進展。區分這兩種腫瘤對于提供適當的臨床治療至關重要，這涉及骨肉瘤患者的新輔助化療。有一種異常罕見的骨肉瘤變體，稱為軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤，這種腫瘤與其良性對應物的組織學表型相似，但顯示具有核異型性和滲透性生長模式[14]。

CB富含的破骨細胞成分與其他富含破骨細胞的骨腫瘤重疊，包括GCTB、動脈瘤性骨囊腫及非骨化性纖維瘤等骨腫瘤。本研究及之前的文獻表明，這些不含有H3F3p.K36M突變[15]。盡管96%的GCTB和70%的動脈瘤樣骨囊腫分別具有H3F3G34突變和USP6重排，但尚未報道其他富含破骨細胞腫瘤的診斷性生物標志物[16-18]。因此，H3F3K36M突變可用于排除這些診斷。

綜上所述，H3F3p.K36M突變在CB中具有獨特性，H3F3p.K36M突變是一種有價值的診斷工具，病理科醫師可以使用它來快速、低成本地提供更準確的診斷。