巨噬細胞移動抑制因子、伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白及循環腫瘤細胞在骨肉瘤中的表達及臨床意義

郭一帆，李龍，程虎

商洛市中心醫院脊柱外科，陜西 商洛 726000

骨肉瘤多發生于兒童及青少年，研究發現，骨肉瘤患者術后5年生存率較低，僅為20%，不利于青少年健康成長，隨著化療手段及技術的進步，骨肉瘤患者5年生存率有了明顯提高[1-2]。臨床仍在不斷尋找有效的、特異性的分子靶向治療方案，從而達到改善患者預后的目的。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibity factor，MIF）是一種細胞因子，與細胞增殖、分化、血管生成相關，在惡性腫瘤中過度表達。伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK）具有干擾腫瘤基因表達、抑制腫瘤轉移的作用，是惡性腫瘤轉移及復發的關鍵因素之一。外周血循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）能在特定條件下進入血液循環，在原發灶或轉移灶腫瘤細胞分化環節中均有參與，可促進腫瘤生成及發展。檢索相關文獻發現，MIF、RECK及CTC在骨肉瘤中均異常表達[3-5]，但關于其與骨肉瘤預后關系的研究鮮有報道。本研究探討MIF、RECK及CTC在骨肉瘤中的表達及臨床意義，為臨床對骨肉瘤患者實施分子靶向治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年2月至2020年2月在商洛市中心醫院治療的骨肉瘤患者的病歷資料。納入標準：①經病理組織學檢查確診為骨肉瘤[6]，且在商洛市中心醫院初次確診；②入院前未接受包括放化療在內的任何治療。排除標準：①確診為骨巨細胞瘤；②合并其他惡性腫瘤；③明顯肝腎功能異常；④合并嚴重內科疾病。根據納入、排除標準，共納入132例骨肉瘤患者，設為觀察組，其中，男性70例，女性62例；平均年齡（32.49±7.41）歲；低中分化69例，高分化63例。選取同期在商洛市中心醫院進行手術治療并經病理檢查確診為軟骨瘤的129例患者，設為對照組，其中，男性73例，女性56例；平均年齡（32.81±7.01）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 MIF、RECK檢測方法收集標本統一進行分割保存，采用免疫組化染色法檢測MIF、RECK蛋白表達情況。將標本從液氮中取出后放入4%多聚甲醛中，固定處理48 h后取出，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，之后將標本包埋處理，做成3 μm厚度的切片。將切片進行免疫組化染色：均經甲醛溶液固定、石蠟包埋、載玻片泡酸、高溫滅菌用PBS洗滌及多聚賴氨酸涂片等處理，隨后進行染色及蘇木精復染、脫水、樹膠封固。最后在顯微鏡下觀察。根據細胞膜或細胞質內的染色強度和陽性細胞比例進行MIF、RECK陽性判定，由兩位病理科醫師獨立打分。陽性細胞比例評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色指數=陽性細胞比例評分+染色強度評分。染色指數≥3分為陽性表達，染色指數＜3分為陰性表達[7]。

1.2.2 CTC檢測方法采用酶聯免疫吸附法檢測血清CTC水平。CTC陽性判定：5 ml外周血中只要發現CTC即可判定為陽性[8]。

1.3 隨訪

對132例骨肉瘤患者進行為期2年的隨訪（隨訪方式為電話隨訪），隨訪截止時間為2022年2月，記錄骨肉瘤患者的生存及死亡情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；影響因素分析采用Cox多元回歸分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MIF、RECK、CTC陽性表達情況的比較

觀察組患者MIF、CTC陽性表達率均明顯高于對照組，RECK陽性表達率明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組患者MIF、RECK、CTC陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.2 不同預后骨肉瘤患者MIF、RECK、CTC陽性表達情況的比較

隨訪2年，132例骨肉瘤患者中，死亡58例，生存74例。死亡患者MIF、CTC陽性表達率均明顯高于生存患者，RECK陽性表達率明顯低于生存患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同預后骨肉瘤患者MIF、RECK、CTC陽性表達情況的比較[ n（%）]

2.3 骨肉瘤患者預后影響因素分析

以性別、年齡、肺部轉移、規律化療、分化程度、MIF表達、RECK表達、CTC表達為自變量，以預后死亡為因變量進行Cox比例風險回歸分析。單因素分析結果顯示：性別、年齡及規律化療情況均可能與患者預后無關，而發生肺部轉移、低中分化、MIF陽性、RECK陰性、CTC陽性均可能與患者預后有關（P＜0.05）。將單因素分析中差異有統計學意義的因素帶入多因素分析，結果顯示：發生肺部轉移、低中分化、MIF陽性、RECK陰性、CTC陽性均為骨肉瘤患者預后死亡的危險因素（P＜0.05）。（表3）

表3 骨肉瘤患者預后死亡的影響因素分析

3 討論

骨肉瘤是常見于間葉組織的原發性惡性腫瘤，有70%～80%的患者發病年齡為10～25歲，以股骨、脛骨、腓骨等部位多發，臨床癥狀為病灶局部疼痛、軟組織腫脹及運動功能受限等[9]。研究發現，骨肉瘤的分子機制復雜，在該病發生的過程中有多種蛋白參與，并影響病情進展[10]。分子靶向治療為目前的研究熱點，通過改變癌基因，在分子水平阻斷腫瘤細胞信號轉導通路，以阻礙腫瘤細胞生長、分化、轉移。

研究發現，MIF有助于惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌等）許多方面的進展，包括細胞增殖、存活、侵襲和血管生成[11]。骨肉瘤多發生于骨骼系統中長骨的兩端，這些部位血管比較豐富，為腫瘤的生長、轉移和復發提供了有利條件，而MIF表達與血管生成、腫瘤細胞轉移密切相關[12]。RECK在腫瘤組織中表達量較低，其作為基質金屬蛋白酶抑制劑，具有調控細胞分化及凋亡的作用，在惡性腫瘤組織中，若RECK表達量顯著降低，則表示腫瘤可能發生侵襲及轉移[13]。CTC存在于外周血中，若在腫瘤原發灶種植，將加重患者病情，為腫瘤轉移及復發創造有利條件。有學者發現，在乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤中，均存在CTC[14]。本研究結果顯示，觀察組患者MIF、CTC陽性表達率均明顯高于對照組，RECK陽性表達率明顯低于對照組，與以往研究所得結果一致[15]。可見MIF、CTC、RECK均與骨肉瘤發生、發展有一定聯系，將三者作為早期骨肉瘤的診斷指標應用于臨床有重要意義。

本研究結果顯示，死亡患者MIF、CTC陽性表達率均明顯高于生存患者，RECK陽性表達率明顯低于生存患者，發生肺部轉移、低中分化、MIF陽性、RECK陰性、CTC陽性均為骨肉瘤患者預后死亡的危險因素，說明MIF、CTC、RECK在骨肉瘤患者預后中發揮重要作用。

綜上所述，MIF、CTC、RECK可用于骨肉瘤患者早期診斷及預后評價中，三者可能為骨肉瘤患者的潛在治療靶點，但MIF、CTC、RECK在骨肉瘤患者中的具體作用機制仍未闡明，有待后續進行深入研究。