血清zonulin、GPC3與妊娠期肝內膽汁淤積癥患者不良妊娠結局的關系*

楊 姍，穆蘭芳，陳玉芬，范曉紅，王淑花

青海省婦女兒童醫院婦產科，青海西寧 810000

妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)是一種多發生于妊娠中晚期的并發癥[1]，臨床表現為皮膚瘙癢、膽汁酸水平升高并可伴有黃疸。由于膽汁淤積肝內，造成肝功能下降，凝血因子合成減少，導致產后出血的風險增加，可引起胎兒窘迫、早產甚至胎死宮內[2]。目前對于ICP的病因及發病機制尚未完全清楚，研究表明其可能與遺傳、免疫及環境因素有關[3]。血清連蛋白(zonulin)是一種調節蛋白，通過調節細胞間緊密連接來增加腸道通透性，是已知的唯一控制腸道通透性的生理蛋白，是腸道滲漏的標志物[4]。在妊娠期間及妊娠后期，ICP患者的腸道通透性增加，細菌內毒素及參與腸肝循環的膽道代謝產物可通過腸道滲漏途徑參與到ICP的發生發展中[5]。同時，作為ICP發病重要一環，膽汁酸的代謝受腸道菌群代謝的影響，腸道菌群的代謝可以顯著影響膽汁酸信號傳導[6]，zonulin也被認為參與到腸道微生態的調節中[7]。因此，zonulin可能與ICP的發病密切相關。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是近年來新發現的一種肝細胞癌血清標志物，在肝細胞癌中特異性高表達[8]，不僅如此，其在膽道閉鎖患兒肝組織中表達升高，與肝功能異常及纖維化程度呈正相關[9]。當前研究表明zonulin、GPC3可能對ICP的疾病發生發展存在一定的預示作用，本文以此為出發點，探索二者聯合檢測對ICP患者不良妊娠結局的預測價值，為ICP的臨床診治提供一定的參考,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2019年1月至2021年5月婦產科就診的150 例 ICP 患者作為觀察組，并選取同期孕周相當(21～34周)的正常妊娠中晚期孕婦150例為對照組。納入標準：(1)年齡 20～40歲，自然受孕且單胎妊娠；(2)處于妊娠中晚期；(3)按照《妊娠期肝內膽汁淤積癥診療指南(2015 )》[1]診斷標準，臨床確診為ICP；(4)本次ICP的發病為初發；(5)未服用影響肝功能及膽汁酸分泌的藥物或保健品；(6)臨床資料完整且愿意參與并配合本研究。排除標準：(1)存在嚴重心、腎等臟器疾??；(2)存在引起皮膚瘙癢的非膽汁淤積性疾??；(3)合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓等妊娠期并發癥；(4)因疾病或其他原因導致無法配合本次研究者。

目前對于ICP的分度主要參照文獻[1],輕度：(1)血清總膽汁酸≥10～40 μmol/L；(2)臨床癥狀以皮膚瘙癢為主，無明顯其他癥狀。重度：(1)血清總膽汁酸≥40 μmol/L；(2)臨床癥狀為瘙癢嚴重；(3)伴有其他情況，如復發性ICP、曾因ICP致圍產兒死亡者；(4)早發型ICP。

按照上述的分度標準將觀察組分為輕度組108例和重度組42例。收集對照組、輕度組、重度組孕婦的一般臨床資料，3組年齡、分娩孕周、分娩次數、流產次數、體重指數(BMI)比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有臨床可比性，見表1。所有患者及家屬均對本研究知情同意并簽署相關知情同意書。本研究獲得本院倫理委員會的批準。

表1 3組孕婦的一般臨床資料

1.2方法 制定臨床信息收集表，收集上述所有孕婦的臨床資料，包括年齡、分娩孕周、分娩次數、流產次數、BMI、妊娠結局等，觀察組于入院第2天清晨空腹檢查血清膽汁酸水平、肝膽功能、血常規、血脂、凝血功能等實驗室指標，對照組來本院產檢前空腹。觀察組及對照組血清zonulin及GPC3檢測方法：抽取所有孕婦空腹靜脈血2～5 mL，離心后取上層保存于-80 ℃冰箱，待所有孕婦血清收集完畢后進行統一檢測，檢測采用酶聯免疫法，試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，嚴格按照操作說明書進行，對所有待測樣本設置3個副孔，結果取均值。

1.3治療方法 按照文獻[1]的標準，熊去氧膽酸是目前ICP治療的一線藥物。按照15 mg/(kg·d)的劑量分3～4次口服，常規劑量效果不佳未出現明顯不良反應時，可加大劑量為1.5～2.0 g/d?？傮w治療目標為緩解瘙癢癥狀，降低血膽汁酸水平，改善肝功能，延長孕周，改善妊娠結局。

1.4不良妊娠結局的判定 不良妊娠結局包括自然流產、早產、過期死、死胎及死產、低出生體重兒、巨大兒、新生兒窒息、出生缺陷、胎兒生長受限、胎兒宮內窘迫、產后出血等，出生缺陷病種參照國際標準(ICD-10編號740～759)進行分類，診斷標準參照《婦產科學》(樂杰主編第7版)及《兒科學》(王衛平主編第8版)，妊娠結局中有任一種異常即為不良妊娠結局。

2 結 果

2.13組孕婦的血清zonulin及GPC3水平比較 對照組血清zonulin、GPC3水平均顯著低于輕度組及重度組，差異有統計學意義(P<0.05)；輕度組血清zonulin、GPC3水平顯著低于重度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清zonulin、GPC3水平比較

2.2觀察組與對照組不良妊娠結局發生情況比較 觀察組的150例ICP患者中40例妊娠結局為不良妊娠，總發生率為26.67%，產后出血、胎兒宮內窘迫、胎兒生長受限、早產、胎兒死亡分別占8.00%、6.67%、 4.67%、6.00%及1.33%；對照組150例孕婦中9例妊娠結局為不良妊娠，總發生率為6.00%，產后出血、胎兒宮內窘迫、胎兒生長受限、早產分別占2.00%、0.67%、1.33%及2.00%。觀察組不良妊娠結局的總發生率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組及對照組不良妊娠結局發生率比較[n(%)]

2.3不良妊娠結局的危險因素分析

2.3.1單因素分析 為進一步探索孕婦發生ICP的危險因素，根據觀察組150例患者是否發生的不良妊娠，分為發生不良妊娠結局組(簡稱不良妊娠組，41例)及未發生不良妊娠結局組(簡稱正常妊娠組，109例)。統計上述兩組孕婦的一般資料(年齡、分娩孕周、分娩次數、流產次數及BMI)、血清血脂指標(膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)、肝膽功能相關指標(總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、血清總膽汁酸、甘膽酸、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶)、凝血功能(凝血酶原時間、凝血酶時間、部分活化凝血活酶時間、纖維蛋白原)及血清zonulin、GPC3水平。在ICP患者中，年齡、總膽紅素、直接膽紅素、總膽汁酸、甘膽酸、部分活化凝血活酶時間、纖維蛋白原水平、血清zonulin水平、血清GPC3水平與ICP患者發生不良妊娠結局密切相關(P<0.05)。見表4。

2.3.2多因素分析 建立非條件Logistic回歸模型，以孕婦發生ICP為應變量，賦值1=發生，0=否。以單因素分析(表4)中P<0.10的指標/因素為自變量。為提高統計效率，并同步于后續的回歸預測模型，將連續數值的自變量，均參考兩組總均值進行分段，轉化成兩分類變量。采用逐步后退法，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。年齡、直接膽紅素、總膽汁酸、纖維蛋白原、血清zonulin、血清GPC3水平均為ICP患者發生不良妊娠結局的危險因素(P<0.05)。見表5。

表4 ICP患者不良妊娠結局的單因素分析

表5 ICP患者不良妊娠結局的多因素分析

2.4血清zonulin及GPC3對ICP患者不良妊娠結局的預測價值 進一步探討血清zonulin及GPC3對ICP患者不良妊娠結局的預測價值：以不良妊娠組(n=41)為陽性樣本，以正常妊娠組(n=109)為陰性樣本，建立ROC曲線診斷分析模型并計算曲線下面積(AUC)，以及按實測樣本計算靈敏度、特異度、準確度。兩個指標單獨及聯合應用時，ROC的AUC(95%CI)分別為0.742(0.557～0.927)、0.721(0.464～0.967)、0.855(0.729～0.979)，診斷效能較高，其中兩個指標的聯合應用更高。見表6。ROC曲線分析見圖1。聯合應用為Log(P/1-P)模式，即建立回歸預測模型，將各單獨應用指標的回歸系數β作為計分參數，歸一化加權計算并對應處理各樣本資料，計算各ROC參數并制作ROC曲線。

表6 血清zonulin及GPC3對ICP患者不良妊娠結局的預測價值

圖1 zonulin及GPC3對不良妊娠結局的預測ROC曲線

3 討 論

ICP是妊娠中晚期常見且嚴重的并發癥之一，雖然發病在母體但對胎兒危害更大，易引起早產、胎兒宮內窘迫、甚至死胎、死產[2]。由于目前發病機制尚不明確，臨床上用于預測ICP不良妊娠結局的手段不足，探索具有預測診斷ICP患者不良妊娠結局的有效生物標志物成為臨床研究之熱點。

zonulin是可逆調節腸道通透性的人類蛋白質，其所調控的腸道滲漏是腸道多種細菌內毒素、膽道代謝產物進入血液循環的重要途徑之一，REYES 等[5]研究指出腸道滲漏可能與ICP的發生發展密切相關。GPC3是一種近年來發現的與原發性肝癌關系較為密切的標志蛋白，其對肝功能的評估也具有一定的價值，于肝細胞損傷的早期即出現升高。GPC3突變可激活Wnt/Frizzled/β-catenin和FGF/PI3K/AKT信號通路，導致細胞的增殖和凋亡失衡，是肝細胞癌(HCC)發生的重要原因之一。同時，GPC3可以與Yes相關蛋白(YAP)相互作用，參與到Hippo通路的調控中，介導HCC的形成。GPC3還可與多種細胞因子，非編碼RNA相互結合，調控HCC的發生發展[10]。在膽道閉鎖性疾病中，GPC3的表達與α-SMA的表達呈明顯的正相關，與肝功能異常及肝纖維化的發生具有密切聯系[11]，其與α-SMA具體機制仍有待進一步闡明。ICP患者肝功能異常，故GPC3可能也參與到ICP的疾病進展中。

本研究結果顯示，對照組血清zonulin、GPC3水平均顯著低于輕度組及重度組，差異有統計學意義(P<0.05)；輕度組血清zonulin、GPC3水平顯著低于重度組，差異有統計學意義(P<0.05)。zonulin作為調節腸道上皮與上皮之間緊密連接的活性蛋白，其在腸道的消化、吸收功能中必然扮演者重要的作用[4]。zonulin在ICP患者中明顯升高可能與以下兩個原因相關：從腸道滲漏的角度而言，腸道的通透性增加可導致各種細菌內毒素進入血液循環，zonulin則是介導“通道”的關鍵，因此，zonulin表達水平的高低可能與ICP患者的病因來源密切相關，zonulin表達水平越高，細菌內毒素則更多地進入血液循環，ICP越為嚴重[12]。從腸循環的角度而言，膽汁酸對腸道中脂肪吸收具有重要的意義[13]，由于zonulin表達水平異常，造成腸道黏膜的吸收功能障礙，繼發性引起腸肝循環及膽汁酸的異常，并最終導致患者出現明顯的肝功能障礙，這可能是ICP患者中血清總膽汁酸明顯升高的原因之一。

GPC3是一種腫瘤標記物，其在多種肝細胞損傷性疾病的早期即明顯升高，是預示肝細胞損傷的良好指標，其表達程度越高提示肝細胞損傷愈為嚴重[9]。因此，GPC3的表達程度越高，ICP患者的病情也越為嚴重。由于膽汁淤積，造成母體肝功能及腸道吸收功能的異常，出現膽紅素代謝及凝血異常的同時可存在有胎兒的發育受限，進而母體可出現瘙癢、出血等，胎兒可有宮內窘迫及發育受限，嚴重可致死胎[14]。本研究中也觀察到zonulin、GPC3是ICP患者發生不良妊娠結局的危險因素(P<0.05)。zonulin的升高加重腸道功能障礙，細菌內毒素及各類膽道代謝產物不斷進入血液循環，GPC3升高導致肝細胞損傷，這些均是對母體肝膽系統的直接打擊，是發生不良妊娠結局的隱患。ROC曲線也證實了二者對妊娠結局具有較好的預測價值，但仍需更大樣本量進行驗證。本研究多因素分析還表明，年齡、直接膽紅素、總膽汁酸、纖維蛋白原水平是ICP患者發生不良妊娠結局的危險因素(P<0.05)。年齡的增長和凝血因子纖維蛋白原異常必然會導致產婦不良妊娠的發生風險增加。直接膽紅素、總膽汁酸是反映機體肝膽系統的重要指標，肝膽系統的異常導致母體肝功能的異常，并最終對妊娠的結局產生影響[15]。

綜上所述，ICP患者血清zonulin及GPC3水平升高，重度患者更高，與ICP患者的不良妊娠結局有關，對ICP患者的不良妊娠結局具有較好的預測價值。同時，本研究也存在樣本數量較少，對ICP患者不良妊娠結局的危險因素分析不夠全面的不足，有待后續研究的進一步開展。