EphA2蛋白與GST-pi蛋白在結直腸癌組織中表達及其預后意義*

陸 軍，張艷皊，陳 潔，張 巖

淮北市人民醫(yī)院病理科，安徽淮北 235000

結直腸癌是我國乃至全世界范圍內最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位列所有腫瘤的第4位，而病死率卻高居所有惡性腫瘤的第2位[1-3]。目前，結直腸癌的早期診斷率仍然很低，許多患者在診斷時已經處于腫瘤進展期。盡管部分患者可以從根治性手術與術后化療等標準治療中獲益，但腫瘤復發(fā)與轉移仍然無法完全避免，已成為目前結直腸癌臨床治療的一個重大挑戰(zhàn)[4-5]。因此，尋找新的預后分子標志對于腫瘤復發(fā)轉移的監(jiān)測與個體化治療決策的制定具有重要的臨床意義。

作為受體酪氨酸激酶Eph家族的重要成員之一，促紅細胞生成素肝細胞A2 (EphA2)蛋白已被報道在細胞增殖、遷移、細胞黏附等多種病理生理過程中發(fā)揮著關鍵作用[6-8]。最近，越來越多的證據證實EphA2蛋白在膀胱癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌等具有高度增殖的上皮細胞腫瘤中呈現明顯高表達，尤其在調控正常細胞的惡性轉化、腫瘤血管生成與侵襲轉移等方面扮演著至關重要的角色[9-13]。在結直腸癌中，有研究報道EphA2蛋白在Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織中顯著過表達，說明其可能參與了疾病發(fā)展的早期階段[14]。然而，關于EphA2蛋白在結直腸癌患者中預后價值的證據依然有限。另一方面，化療耐藥亦是結直腸癌術后復發(fā)轉移的重要因素之一。谷胱苷肽S-轉移酶Pi(GST-pi)蛋白是谷胱甘肽S-轉移酶家族成員之一，在異源物質的代謝、解毒等生物轉化過程中具有重要的作用[15]。研究表明，GST-pi蛋白與包括肺癌在內的多種惡性腫瘤的化療敏感性及預后相關[16-18]。然而，尚不清楚GST-pi蛋白在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及其潛在的預后意義。為了進一步明確以上兩種分子標志物的預后作用，本研究應用免疫組化染色方法檢測了114例結直腸癌組織中EphA2蛋白與GST-pi蛋白的表達情況，分析了EphA2蛋白與GST-pi蛋白表達與結直腸癌臨床病理學參數及患者預后的關系，期望這些發(fā)現能夠為結直腸癌患者的預后評估及分子靶向治療提供更多研究證據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 本研究的組織標本來源于2014年6月至2020年2月在本院診斷為結直腸癌并行手術治療的114例患者，其中男性65例(57.0%)，女性49例(43.0%)，年齡39～86歲，平均(63.9±11.5)歲。所有患者均經術后組織病理學證實為原發(fā)性腺癌，術前未曾接受過任何新輔助放、化療或其他治療，且具有完整的臨床與隨訪資料。收集114例患者的臨床病理學資料，包括患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤最大徑、組織學類型、T分期、淋巴結轉移(N分期)、淋巴血管侵犯、神經侵犯等,腫瘤的組織學分類依據世界衛(wèi)生組織(WHO)標準確定，結直腸癌的T分期與N分期方案參照美國癌癥聯合會第7版TNM分期系統(tǒng)。本研究的執(zhí)行已經過本院醫(yī)學倫理學委員會的審批，在標本采集之前已取得所有患者的知情同意。

1.2免疫組化方法 手術切除的標本分別按照癌組織與匹配的癌旁組織進行配對，以距腫瘤組織5 cm以外未受到腫瘤侵犯的正常腸黏膜作為癌旁組織，并采用福爾馬林固定、石蠟包埋。采用切片機將石蠟包埋的結直腸癌組織和癌旁組織標本進行連續(xù)切片，厚度為4 μm；隨后將癌與癌旁組織切片置于二甲苯中脫蠟、梯度酒精中進行水化處理，并應用pH值為7.4的檸檬酸鹽緩沖液修復抗原。在室溫下，使切片在3%過氧化氫溶液中處理10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性。使用1%胎牛血清封閉組織切片，并將1∶200稀釋的EphA2蛋白(Abcam公司)與GST-pi蛋白(Abcam公司)一抗加至切片上，4 ℃過夜。次日，將癌組織與癌旁組織切片用PBS緩沖液清洗3遍，繼續(xù)于室溫下加入辣根過氧化物酶HRP標記二抗，孵育30 min；隨后將切片與DAB孵育5 min，蘇木素復染。

1.3結果判讀 光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)，通過染色強度(0分:染色缺失；1分:弱染色，呈淺黃色；2分:適度染色，呈棕黃色；3分:強染色，呈棕褐色)與染色范圍(計數200個細胞，0分:染色陽性細胞的百分比<5%，1分:5%～25%，2分:>25%～50%，3分:>50%～75%，4分:>75%)。對每張組織切片的免疫染色進行半定量評分，并將染色強度與染色范圍的積分相乘，得到免疫組化染色的總評分，其中0～4分認為陰性表達，>4分認為陽性表達。

1.4隨訪 所有接受手術治療的結直腸癌患者均在術后接受定期隨訪，全組患者隨訪資料完整，無失訪病例，隨訪時間為1～71個月，中位隨訪時間為36個月。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗或Fisher′s精確檢驗對EphA2蛋白、GST-pi蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系進行分析；采用Kaplan-Meier法估算EphA2蛋白與GST-pi蛋白陽性與陰性表達組患者的總生存率，生存差異的比較采用對數秩檢驗log-Rank檢驗。另外，通過Cox比例風險回歸模型對影響結直腸癌患者預后的潛在風險因素進行單、多因素分析。所有統(tǒng)計分析均為雙側，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1組織標本 本研究共收集匹配的結直腸癌標本114例，在114例標本中60例(52.6%)為結腸癌，54例(47.4%)為直腸癌，平均腫瘤最大徑為(5.6±1.7)cm;根據組織學類型，80例(70.2%)為高、中分化腺癌，34例(29.8%)為低分化腺癌;全組患者標本包括T1～T2期39例(34.2%)，T3～T4期75例(65.8%)，淋巴結轉移率為48.2%(55/114);21.1%(24/114)出現淋巴血管侵犯，14.9%(17/114)出現神經侵犯。

2.2EphA2蛋白、GST-pi蛋白在結直腸癌標本中的表達 免疫組化染色結果顯示，EphA2蛋白與GST-pi蛋白在胞漿與胞核中均有陽性表達，見圖1。在114例結直腸癌組織中，EphA2蛋白與GST-pi蛋白的陽性表達率分別為54.4%和62.3%，顯著高于二者在癌旁組織中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 比較EphA2蛋白與GST-pi蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達情況[n(%)]

注：A為EphA2蛋白在結直腸癌組織中的表達；B為EphA2蛋白在癌旁組織中的表達；C為GST-pi蛋白在結直腸癌組織中的表達；D為GST-pi蛋白在癌旁組織中的表達。

2.3EphA2蛋白、GST-pi蛋白表達與臨床病理特征的關系 與EphA2蛋白陰性表達患者相比，EphA2蛋白陽性表達患者的腫瘤最大徑>5 cm占比、有淋巴結轉移占比、有淋巴血管侵犯占比更高。見表2。GST-pi蛋白表達與結直腸癌患者的腫瘤最大徑及T分期有關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤位置、組織學類型、淋巴結轉移、淋巴血管侵犯、神經侵犯無關 (P>0.05)，見表3。

表2 EphA2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 GST-pi蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

續(xù)表3 GST-pi蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4EphA2蛋白、GST-pi蛋白表達在結直腸癌患者中的預后意義 隨訪期內共50例患者死亡，全組患者的3年與5年總生存率分別為68.3%和43.3%。Kaplan-Meier生存分析表明EphA2蛋白陽性表達患者的預后較EphA2蛋白陰性表達患者明顯更差，二者的5年總生存率分別為20.1%和68.8%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.973,P<0.001)，見圖2A。GST-pi蛋白陽性表達與GST-pi蛋白陰性表達患者的5年總生存率分別為28.2%和61.8%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.974,P=0.046)，見圖2B。

注：A為EphA2蛋白表達與結直腸癌患者總生存率的關系；B為GST-pi蛋白表達與結直腸癌患者總生存率的關系。

為了進一步明確EphA2蛋白、GST-pi蛋白表達在結直腸癌患者中的預后價值，結合其他臨床病理參數進行了單、多變量Cox回歸分析，結果表明，EphA2蛋白陽性表達[風險比(HR)=3.442,95%CI：1.722～6.881，P<0.001]、GST-pi蛋白陽性表達 (HR=2.203,95%CI：1.088～4.460，P=0.028)、淋巴結轉移(HR=3.627,95%CI：1.699～7.742，P=0.001)及淋巴血管侵犯(HR=2.113,95%CI：1.033～4.322，P=0.040)是結直腸癌患者預后不佳的獨立預測因素，見表4。

表4 結直腸患者預后風險因素的單、多變量Cox分析

3 討 論

盡管結直腸癌的綜合治療如手術切除、放化療、分子靶向藥物等在過去的二十年中已取得了重大進展，但術后腫瘤復發(fā)轉移仍然是目前抗腫瘤治療面臨的主要挑戰(zhàn)[4]。探索驅動結直腸癌復發(fā)轉移的分子標志與潛在機制是評估患者預后及開發(fā)新型治療方法的必要條件[19-20]。在這項研究中，應用免疫組化染色檢測了兩種蛋白EphA2蛋白與GST-pi蛋白在結直腸癌標本中的表達，評估了其在患者中預后意義。 本研究證據表明EphA2蛋白與GST-pi蛋白在結直腸癌組織中呈明顯陽性表達，二者是結直腸癌患者預后不佳的預測標志。這些發(fā)現提示EphA2蛋白與GST-pi蛋白或許參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，二者可能是結直腸癌治療的新型潛在靶點。

EphA2蛋白在細胞轉化、腫瘤血管生成與轉移中的作用使其多年來始終是癌癥研究領域的焦點之一[8,21]。據報道，EphA2蛋白在包括前列腺癌、胃癌及肝細胞癌等多種惡性腫瘤中均有陽性表達，并且被確定為這些腫瘤不良預后的分子標志物[11,22-23]。BOGAN等[24]研究表明EphA2基因ApcMin/+小鼠中的表達缺失顯著減少了腸道腫瘤的大小與數量，表明EphA2在腸道腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著至關重要的作用。本研究結果顯示，與EphA2蛋白陰性表達患者相比，EphA2蛋白陽性表達患者的腫瘤最大徑>5 cm占比、有淋巴結轉移占比、有淋巴血管侵犯占比更高，提示EphA2蛋白可能參與了結直腸癌的發(fā)生與進展。DUNNE等[14]的研究進一步證實EphA2蛋白作為重要的腫瘤促進因子，調控了結直腸癌細胞的遷移與侵襲。MARTINI等[25]報道了EphA2蛋白高表達與西妥昔單抗獲得性耐藥的關系，研究發(fā)現外源性下調EphA2蛋白表達可以通過誘導細胞凋亡和細胞周期G1～G2阻滯，抑制結直腸癌細胞的生長，從而逆轉腫瘤細胞對西妥昔單抗的耐藥性。這些發(fā)現進一步支持了EphA2蛋白在結直腸癌進展、轉移及獲得性耐藥中的作用，表明其可能為這些患者提供了一個新的治療選擇。

GST-pi蛋白是一類在人體生物轉化過程中發(fā)揮重要的作用的代謝酶，研究發(fā)現其可以通過激活腫瘤細胞膜上的ATP依賴性轉運酶，加速化療藥物從腫瘤細胞中排出，降低藥效，增加腫瘤細胞對化療藥物的抗性[26-27]。盡管很多研究報道了GST-pi蛋白在惡性腫瘤中的異常表達，但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學作用卻始終未取得一致意見[28-29]。WANG等[28]報道GST-pi蛋白在食管鱗癌標本中呈明顯表達下調，GST-pi蛋白表達缺失提示患者預后不佳。然而，有研究發(fā)現在卵巢癌、肺癌等腫瘤標本中GST-pi蛋白表達水平顯著高于其對應的癌旁組織，是影響患者預后的獨立因素[29]。本研究通過免疫組化染色證實GST-pi蛋白表達與結直腸癌患者的腫瘤最大徑及T分期有關(P<0.05)，且GST-pi蛋白陽性表達是結直腸癌患者預后不佳的獨立預測因素之一。GST-pi蛋白的異常表達可能是結直腸癌的發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，其或許通過介導DNA損傷，增加基因組不穩(wěn)定，促進腫瘤的癌變[30]。因此，值得開展進一步研究，以明確GST-pi蛋白在結直腸癌中的致癌作用。

綜上所述，本研究的結果表明EphA2蛋白與GST-pi蛋白在結直腸癌中呈明顯陽性表達，并與腫瘤的侵襲性生物學特征及不良預后有關，二者或許可作為結直腸癌患者預后評估的重要指標。