SFRP5調控Wnt/β-Catenin信號通路對子癇前期滋養細胞遷移和侵襲的作用機制研究*

李 娜,彭 娜,姚 霞,朱 燕,賈建桃

1.長治醫學院附屬和濟醫院產科，山西長治 046000；2.長治醫學院基礎醫學部，山西長治 046000

子癇前期(PE)是臨床常見的妊娠期特異性并發癥，好發于妊娠20周以后，是導致孕婦死亡的重要原因[1]。PE的主要癥狀為高血壓和尿蛋白升高，如未得到及時有效治療，可引起胎盤早剝、胎兒生長受限、圍產期死亡等多種不良妊娠結局。同時，顯著增加胎兒未來罹患心血管疾病的風險[2]。目前普遍認為，絨毛膜滋養細胞遷移和侵襲減少引起的胎盤功能障礙是PE的核心病理基礎，但其調控機制尚未闡明[3]。研究表明，PE發病機制受到多種信號通路的調控，如Notch、MAPK、Wnt和NF-κB等[4-6]。其中，經典的Wnt/β-catenin信號通路在調節胚胎黏附、著床、滋養層細胞融合、增殖、侵襲和分化等方面發揮重要作用[7]。因此，探索PE過程中調控Wnt/β-catenin信號通路的病理因素具有重要意義。分泌卷曲相關蛋白5(SFRP5)作為分泌型糖蛋白家族成員之一，結構上與Wnt信號特異性卷曲蛋白(Fz)受體極為相似，可競爭性抑制Wnt蛋白活性[8]。有研究顯示，SFRP5可通過作用于Wnt信號通路抑制腫瘤細胞的生長、侵襲、遷移和腫瘤形成，發揮抑癌作用[9-10]。但SFRP5與PE的關系及對滋養細胞的影響目前鮮少研究。本研究旨在評估SFRP5在PE患者胎盤和血清中的水平，并探討其對人類滋養細胞遷移和侵襲的影響，揭示PE的潛在分子機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年10月在長治醫學院附屬和濟醫院(簡稱本院)產科收治的15例PE患者(PE組)和15例健康孕婦(正常組)及作為研究對象，收集研究對象剖宮產手術中獲得的胎盤組織和血液樣本。納入標準：(1)PE患者符合人民衛生出版社(第9版)《婦產科學》中的相關診斷標準；(2)年齡18～40歲，孕周34～40周，孕前體重指數(BMI)為18.5～24.9 kg/m2；(3)75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)陰性；(5)單胎妊娠；(6)剖宮產分娩。排除標準：(1)孕前合并高血壓、內分泌和免疫系統疾病、惡性腫瘤及傳染病；(2)有不良孕產史；(3)有其他妊娠合并癥及并發癥。另選取在本院同期妊娠7～10周無任何并發癥的人工流產孕婦5例作陰性對照，納入研究的患者均簽署知情同意書，且本研究通過本院倫理委員會審核(GS20190622)。

1.2儀器與試劑 RPMI 1649培養基購自美國Gibco公司，貨號21870084；胎牛血清購自美國Gibco公司，貨號10099141；免疫組化染色試劑盒購自上海碧云天公司，貨號SP-9000；氯化鋰(LiCl)購自美國Sigma公司，貨號L9650；重組Dickkopf相關蛋白1(Dkk-1)購自美國Sigma公司，貨號SRP3258；CCK8試劑盒購自北京索萊寶公司，貨號CA1210；重組人SFRP5蛋白購自美國Abcam公司，貨號ab202176；SFRP5 ELISA試劑盒購自武漢USCN公司，貨號E-EL-H5544c；多重基質金屬蛋白酶(MMP)酶譜檢測試劑盒購自北京普利萊公司，貨號P1700；糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抗體購自美國Cell signaling technology公司，貨號9327S；SFRP5抗體購自美國Abcam公司，貨號ab230425；β-catenin購自美國Santa Cruz公司，貨號sc-7963；β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，貨號sc-81178。細胞培養箱購自美國NUAIRE公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；FC型酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3方法

1.3.1組織樣本采集 剖宮產手術前收集PE組和正常組空腹靜脈血5 mL，離心提取血清，-80 ℃保存備用。陰性對照孕婦術中胎盤娩出后0.5 h內，從母體面剝離未見明顯梗死、鈣化、血腫或撕裂、位于臍帶插入點和胎盤外周邊緣之間約1 cm3的胎盤組織，保存在-80 ℃冰箱中，用于后續蛋白免疫印跡實驗研究。另取PE組部分新鮮足月胎盤組織用4%多聚甲醛固定用于免疫組化染色，以及收集陰性對照孕婦的妊娠初期蛻膜和胎盤絨毛組織。

1.3.2免疫組化染色檢測胎盤組織SFRP5表達 取經4%多聚甲醛固定后的胎盤組織，常規石蠟包埋、切片(4 μm)、脫蠟、水化后，3%雙氧水甲醇溶液中孵育10 min以淬滅內源性過氧化物酶活性，0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中煮沸20 min以恢復抗原。室溫下山羊血清封閉15 min，加入SFRP5抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。次日，磷酸鹽緩沖液充分洗滌后，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h。最后加入二氨基聯苯胺顯色，蘇木精反染，封片，顯微鏡拍照記錄，陽性表達為棕黃色。以正常組健康人體皮膚組織作為陽性對照，陰性對照孕婦的妊娠初期蛻膜、胎盤絨毛組織、正常組足月胎盤組織為正常對照，正常對照、陽性對照石蠟切片由本院病理科提供。

1.3.3酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)檢測血清SFRP5表達 采集PE組和正常組的空腹血樣，4 ℃靜置4 h，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min離心，取上清液，使用SFRP5 ELISA試劑盒檢測血清中SFRP5水平。

1.3.4滋養細胞培養和分組 人絨毛膜滋養層細胞HTR8/SVneo(簡稱HTR8/SVneo滋養細胞)購自ATCC中國細胞庫。常規復蘇后，置于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1649培養基中，放置在含有5% CO2的37 ℃全濕度細胞培養箱中培養。當細胞融合率達到80%～90%時傳代處理。HTR8/SVneo滋養細胞隨機分為6組：對照組、SFRP5組、LiCl組、SFRP5+LiCl組、Dkk-1組和Dkk-1+LiCl組。

胰酶消化細胞重新懸浮并接種于6孔板。細胞聚集達60%～70%后，更換為無血清培養基。根據已報道文獻[11]實驗劑量，6組HTR8/SVneo滋養細胞按照重組人SFRP5蛋白(100 ng/mL)、LiCl(1 mmol/L)和重組人Dkk-1蛋白(50 ng/mL)的劑量處理24 h后做后續HTR8/SVneo滋養細胞遷移和侵襲檢測實驗研究，對照組HTR8/SVneo滋養細胞不作任何處理。

1.3.5CCK-8法檢測HTR8/SVneo滋養細胞活力 將HTR8/SVneo滋養細胞(5×103個/mL)接種于96孔板中培養12 h。細胞貼壁后更換無血清培養基，放入37 ℃的5% CO2細胞培養箱中繼續培養。根據文獻[12-13]報道藥物處理濃度，用含有不同濃度LiCl(10、20、50、100、200和500 μmmol/L，1、2、5、10、20、30、40和50 mmol/L)和Dkk-1(1、2、5、10、20、50、60、80和100 ng/mL)的新鮮培養基替換原培養基。培養12 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續培養1 h。根據每孔細胞在450 nm波長下的吸光度(A值)計算細胞活力。

1.3.6劃痕實驗檢測HTR8/SVneo滋養細胞遷移 將HTR8/SVneo滋養細胞接種于6孔板中，并接受1.3.3描述方法處理。細胞量達到90%后，用10 μL無菌槍頭對細胞單層沿直線做輕輕劃痕，培養24 h。在0、6、12和24 h，用光學顯微鏡40倍放大拍照記錄圖像。使用Image J評估劃痕愈合面積，并計算遷移面積：遷移面積=0 h劃痕愈合面積-24 h劃痕愈合面積。

1.3.7基底膠Transwell侵襲實驗檢測HTR8/SVneo滋養細胞侵襲能力 以基底膠(1∶9稀釋)預涂于 Transwell小室。將HTR8/SVneo滋養細胞以1.0×105個/小室接種于上述Transwell小室，并在下室加入600 μL含有10% FBS的培養基。培養24 h后，甲醇固定，結晶紫染色，清洗，拍照。顯微鏡下隨機選取5個視野進行記數求平均值。

1.3.8明膠酶譜實驗檢測HTR8/SVneo滋養細胞MMP活性 收集6組HTR8/SVneo滋養細胞培養液上清液。將明膠加入0.1% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺分離膠中，加入6組HTR8/SVneo滋養細胞培養液上清液后進行電泳。用50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 7.5)、5 mmol/L CaCl2和2.5%聚乙二醇辛基苯基醚清洗凝膠，37 ℃下孵育過夜。考馬斯亮藍染色，洗脫，保存，并干燥。采用凝膠成像系統掃描拍照，以Image J軟件分析圖像，以6組HTR8/SVneo滋養細胞MMP條帶與空白對照條帶恢復值之比表示MMP活性。

1.3.9蛋白免疫印跡法檢測各組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β、β-catenin、SFRP5蛋白表達水平 用RIPA裂解緩沖液將經過各種處理的HTR8/SVneo滋養細胞提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。6組HTR8/SVneo滋養細胞按25 μg蛋白上樣量經10% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，200 mA恒流轉膜到聚偏氟乙烯膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后，加入GSK3β、β-catenin、SFRP5和β-actin的特異性抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 500稀釋)孵育1 h。使用增強化學發光法檢測，拍照，以β-actin為內參，使用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結 果

2.1兩組一般情況比較 與正常組相比，PE組年齡、孕初BMI和孕期增重比較差異均無統計學意義(P>0.05)。PE組平均收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)比正常組升高，而新生兒出生體重和胎盤重量比正常組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PE組與正常組一般情況比較

2.2正常組和PE組胎盤組織和血清中SFRP5的表達比較 免疫組化法檢測結果顯示，與陽性對照比較，正常組和PE組中均為SFRP5陰性表達。見圖1。ELISA結果顯示，與正常組[(9.03±1.75)ng/mL)]相比，PE組血清SFRP5水平[(48.07±3.81)ng/mL]顯著升高，差異有統計學意義(t=36.063、P<0.001)。

注：A～J免疫組化染色，A、B、C、G和H依次為D、E、F、I和J所示黑色虛線框內區域的放大圖像；A/D為陽性對照，箭頭表示SFPR5陽性角質細胞；E、F、I/B、C、G為正常對照，E/B為陰性對照孕婦的妊娠初期蛻膜組織、F/C為陰性對照孕婦的妊娠初期胎盤絨毛組織、I/G為正常組足月胎盤組織；J/H為PE組足月胎盤組織。

2.3Dkk-1和LiCl刺激對HTR8/SVneo滋養細胞活力的影響 CCK8法檢測結果顯示，不同濃度Dkk-1和LiCl刺激對HTR8/SVneo滋養細胞活力產生不同的影響，無明顯梯度規律，見圖2。與對照組比較，1 mmol/L LiCl和50 ng/mLDkk-1對HTR8/SVneo滋養細胞活力的抑制作用最小，差異有統計學意義(t=4.953、3.162,P<0.05)。

注：a表示CCK8法檢測梯度濃度LiCl對HTR8/SVneo滋養細胞的活性影響；b表示CCK8法檢測梯度濃度Dkk-1對HTR8/SVneo滋養細胞的活性影響；藍柱表示LiCl和Dkk-1的最適濃度；與對照組比較，*P<0.05。

2.4SFRP5對HTR8/SVneo滋養細胞遷移的影響 劃痕實驗結果顯示，SFRP5+LiCl組、SFRP5組、LiCl組、對照組、Dkk-1組和Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比分別為(14.6±1.2)%、(5.4±0.2)%、(52.4±0.9)%、(34.2±0.8)%、(1.8±0.3)%和(22.1±0.6)%。可見，SFRP5組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比顯著小于對照組，差異有統計學意義(t=11.762、P<0.001)。與對照組相比，LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比顯著增加(t=4.389、P=0.007)；與LiCl組相比，SFRP5組和SFRP5+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比明顯降低(t=8.082、P<0.001；t=4.93、P=0.004)；與LiCl組相比，SFRP5+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比亦顯著降低(t=12.471、P<0.001)。此外，Dkk-1組和Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞的24 h劃痕愈合百分比均顯著低于對照組(t=8.655、P<0.001；t=1.681、P=0.154)；與LiCl組相比，Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞24 h劃痕愈合百分比亦顯著降低(t=12.023、P<0.001)，見圖3。

圖3 6組HTR8/SVneo滋養細胞遷移能力比較(×40)

2.5SFRP5對HTR8/SVneo滋養細胞侵襲能力的影響 基底膠Transwell侵襲實驗結果顯示，SFRP5+LiCl組、SFRP5組、LiCl組、對照組、Dkk-1組和Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數分別為(129.78±2.91)個、(84.67±3.34)個、(487.98±5.43)個、(159.89±2.69)個、(41.67±2.96)個和(81.32±3.67)個。與對照組相比，SFRP5組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量明顯降低(t=14.434、P<0.001)；LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量顯著增多(t=3.712、P=0.014)。與LiCl組相比，SFRP5組和SFRP5+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量均明顯減少(t=7.670、P<0.001；t=6.757、P<0.001)；與LiCl組相比，SFRP5+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量亦顯著降低(t=6.166、P<0.001)。與對照組相比，Dkk-1組和Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量均顯著降低(t=33.541、P<0.001；t=8.385、P<0.001)；與LiCl組相比，Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞侵襲細胞數量亦顯著降低(t=8.305、P<0.001)，見圖4。

圖4 SFRP5處理后HTR8/SVneo滋養細胞侵襲比較(×200)

2.6SFRP5對各組HTR8/SVneo滋養細胞MMP-2/9活性的影響 明膠酶譜法檢測HTR8/SVneo滋養細胞中MMP-2/9活性，結果顯示，與對照組HTR8/SVneo滋養細胞MMP-2/9活性[依次為(1.02±0.04)和(1.06±0.03)]相比，SFRP5組HTR8/SVneo滋養細胞MMP-2(0.58±0.09)和MMP-9(0.52±0.23)活性均顯著降低，差異有統計學意義(t=4.193、P=0.016；t=2.887、P=0.034)。見圖5。

圖5 SFRP5處理后HTR8/SVneo滋養細胞中MMP-2/9活性

2.7SFRP5對HTR8/SVneo滋養細胞中Wnt/β-Catenin信號通路表達的影響 蛋白免疫印跡結果表明，對照組HTR8/SVneo滋養細胞SFRP5蛋白陰性表達，這與胎盤免疫組化的結果一致；與對照組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達、β-catenin表達[依次為(1.05±0.03和1.02±0.02)]比較，SFRP5組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達(1.72±0.87)增加，β-catenin表達(0.21±0.04)減少，差異有統計學意義(t=10.392、P<0.01,t=12.124、P<0.001)；與對照組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達、β-catenin表達比較，LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達(0.24±0.05)降低，β-catenin表達(1.33±0.13)增加(t=5.196、P=0.003，t=7.031、P<0.001)；與對照組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達、β-catenin表達比較，Dkk-1組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達(2.26±0.46)增加，β-catenin表達(0.16±0.05)降低(t=8.660、P<0.001，t=15.155、P<0.001)。與LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞β-catenin表達、GSK3β表達[依次為(1.33±0.13和0.24±0.05)]相比，SFRP5+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞β-catenin表達(0.54±0.09)降低(t=6.433、P<0.001)，而GSK3β表達(0.31±0.06)比較差異無統計學意義(t=2.004、P=0.076)；與LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達、β-catenin表達相比，Dkk-1+LiCl組HTR8/SVneo滋養細胞GSK3β表達(8.23±1.43)增加，而β-catenin表達(0.33±0.06) 降低(t=16.267、P<0.001，t=6.193、P<0.001)。見圖6。

圖6 SFRP5處理促進HTR8/SVneo滋養細胞中SFRP5、GSK3β和β-catenin蛋白的表達

3 討 論

PE是造成當今世界圍產期病死率的主要原因之一，每年約導致6萬名產婦死亡[2]。然而，目前臨床缺乏有效的預防和治療方法，這與PE的具體病因尚未完全闡明有關。研究發現，Wnt/β-catenin信號通路作為可調控細胞增殖、遷移、侵襲和死亡等生物學過程的重要信號轉導通路，其活性異常參與多種產科、婦科和代謝性疾病[14]。最近的研究表明，重度PE胎盤中Wnt、β-catenin、c-myc和cyclinD1表達水平較對照組顯著降低[15-16]。提示Wnt/β-catenin信號通路異常可能參與調控PE的發生發展。SFRP5是分泌卷曲相關蛋白家族的成員，由于其在結構上與Wnt信號通路中的Fz受體非常相似，故通常作為Wnt信號通路抑制劑而被人們所熟知[8]，但SFRP5與PE的關系及對滋養細胞的作用尚不明確。

本研究結果發現，與正常組比較，PE組血清SFRP5水平明顯升高。而正常對照及PE組胎盤組織中SFRP5陰性表達，這提示血清SFRP5的異常升高可能參與了PE的發展。研究發現，SFRP5啟動子可發生高甲基化，在一些腫瘤組織中SFRP5的表達減少[9-10]。推測啟動子甲基化對SFRP5的表觀遺傳學沉默可能導致SFRP5在胎盤組織陰性表達。因此，與PE相關的血清SFRP5水平增高可能并非來源于胎盤。脂肪組織是一個高度活躍的SFRP5分泌組織，并通過產生炎癥介質與PE相關的炎癥狀態相關[17]。因此，假設血清中SFRP5的增加可能來自于PE患者的脂肪組織，然而，本研究僅檢測了SFRP5的蛋白表達，未研究mRNA的轉錄和啟動子甲基化，需要進一步的大規模基因轉錄相關研究來進一步解釋其血清升高的原因。

Wnt通路調控許多發育過程，包括細胞命運的規范和細胞極性。而在疾病病理過程中，Wnt信號與癌細胞和滋養細胞的增殖及轉移有關[18]。MMP-2和MMP-9是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點[19]。作為Wnt抑制劑，SFRP5在胚胎和內胚層發育過程中抑制典型和非典型的Wnt信號傳導途徑[20]。由β-catenin的聚集和核轉位激活的經典Wnt信號，促進滋養細胞的侵襲性分化[21]。有研究發現，在癌細胞和多能干細胞中，SFRP5通過降低磷酸化GSK3β和非磷酸化β-catenin(活性β-catenin)及隨后的T細胞轉錄因子4(TCF4)/淋巴增強子結合因子1(LEF1)介導的基因表達，使Wnt/β-catenin信號途徑失活[22]。由于早期胎盤滋養細胞的侵襲行為與腫瘤細胞相似，假設SFPR5可能對它們的功能有類似的影響。在體外實驗中利用SFRP5重組蛋白，發現SFRP5通過增加GSK3β和降低β-catenin的水平來抑制滋養細胞的遷移和侵襲。進一步的研究發現，SFRP5可降低MMP-2和MMP-9的活性。而MMP-2和MMP-9作為Wnt/β-catenin信號通路的下游蛋白酶，可通過分解蛻膜細胞外基質促進滋養細胞的遷移和侵襲。這些結果提示，SFRP5可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路及其下游MMP2/9的活性對滋養細胞遷移和侵襲能力產生抑制作用。

本研究發現LiCl處理可促進HTR8/SVneo滋養細胞的遷移和侵襲，并上調β-catenin的表達。與SFRP5相似，Dkk-1抑制了滋養細胞的遷移和侵襲能力及經典Wnt/β-catenin通路。此外，SFRP5和Dkk-1可減弱LiCl的效應。總之，本研究結果表明，SFRP5的過度激活可能通過抑制Wnt/β-catenin途徑在HTR8/SVneo滋養細胞功能障礙中發揮關鍵作用。

綜上所述，SFRP5可能通過負向調控Wnt/β-catenin途徑和下游的MMP-2和MMP-9，抑制HTR8/SVneo滋養細胞的遷移和侵襲，導致HTR8/SVneo滋養細胞功能障礙和PE的發生發展。因此，本研究的結果從一個新的角度仔細研究了PE的發病機制，并在未來為PE提供了新的治療靶點。