谷氨酰胺酶抑制劑CB-839介導(dǎo)T細(xì)胞效應(yīng)抑制肺癌細(xì)胞中αKGA、Gln轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制*

張啟新，周 游，黃 飛△

南通市海門區(qū)人民醫(yī)院:1.胸外科;2.病理科，江蘇南通 226100

肺癌是由于下呼吸道產(chǎn)生病變或腺體組織發(fā)生異常所引起的一種重大疾病，其可分為兩種病型：中央型，產(chǎn)生于支氣管與葉支氣管中，常見會(huì)引發(fā)鱗癌等；周圍型，產(chǎn)生在下支氣管和肺泡中，常見會(huì)引發(fā)腺癌[1]。導(dǎo)致肺癌產(chǎn)生的原因復(fù)雜多樣，長(zhǎng)期吸煙、環(huán)境影響、不健康飲食習(xí)慣及患有嚴(yán)重的肺部疾病等均可引起肺癌的發(fā)生。肺癌患者病情的嚴(yán)重程度與腫瘤發(fā)生的部位及大小等聯(lián)系甚密。肺癌早期存在隱匿性，一般無(wú)明顯臨床特征，中晚期主要臨床癥狀為咳嗽、咯血等。神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織是肺癌細(xì)胞最常見的轉(zhuǎn)移部位，且其轉(zhuǎn)移的部位與其臨床產(chǎn)生的病癥聯(lián)系密切，此外，肺癌還可轉(zhuǎn)移至肝臟、胃腸道等[2]。谷氨酰胺酶抑制劑CB-839(簡(jiǎn)稱CB-839)是一種針對(duì)癌細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺(Gln)代謝依賴所研究的靶向藥物，且已有研究證實(shí)，CB-839對(duì)宮頸癌、黑色素瘤均有顯著的抗腫瘤作用[3-4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，參與腫瘤的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)高比率的T細(xì)胞，在肺癌中發(fā)現(xiàn)其與癌細(xì)胞的侵襲呈正相關(guān)[5-7]。上述研究提示，T細(xì)胞在腫瘤組織中大量聚集導(dǎo)致癌細(xì)胞通過(guò)免疫逃逸形成腫瘤。Gln參與細(xì)胞生長(zhǎng)。報(bào)道顯示，在肺癌中Gln可影響癌細(xì)胞的增殖，抑制其水平后可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[8]。α-酮戊二酸(αKGA)作為Gln的前體物質(zhì)，是三羧酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，與氨結(jié)合生成谷氨酸和Gln。αKGA能有效促進(jìn)機(jī)體氮代謝，可以降低銨離子對(duì)機(jī)體的毒性[9]。目前，關(guān)于CB-839對(duì)腫瘤T細(xì)胞效應(yīng)及Gln轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不明確，因此，本文研究CB-839介導(dǎo)T細(xì)胞效應(yīng)抑制肺癌細(xì)胞αKGA向Gln轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物來(lái)源 人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自上海匹拓公司，10只SPF級(jí)健康SD裸鼠購(gòu)自北京億鳴復(fù)興公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0311，體重20～25 g，鼠齡2～4周，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境許可證號(hào):0011277。本次實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：20200227)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 CB-839(上海阿拉丁公司)、MTT溶液(南京森貝伽公司)、青霉素(山東康迪公司)、流式細(xì)胞儀(邢臺(tái)瑞聯(lián)公司)、酶標(biāo)儀(山東恒美公司)、αKGA試劑盒(泉州睿信公司)、鏈霉素(武漢羅森杰公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與肺癌細(xì)胞A549與CB-839共培養(yǎng) A549細(xì)胞于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%左右時(shí)傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，收集細(xì)胞(5×104個(gè)/mL)并接種到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。次日，細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組。CB-839濃度參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，Ⅰ組常規(guī)培養(yǎng)，Ⅱ組給予0.25 μmol/L濃度CB-839、Ⅲ組給予0.50 μmol/L濃度CB-839、Ⅳ組給予1.00 μmol/L濃度CB-839。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，見圖1。

注：A(Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或多角形,部分細(xì)胞有突起，可見處于不同分裂相的細(xì)胞，增殖能力較強(qiáng)，細(xì)胞散在分布，體積較大，輪廓較清晰，邊緣光滑，細(xì)胞質(zhì)豐富透亮；B(Ⅱ組肺癌A549細(xì)胞)、C(Ⅲ組肺癌A549細(xì)胞)和D(Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞)細(xì)胞可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，許多細(xì)胞形態(tài)回縮變圓、與周圍細(xì)胞脫離，甚至脫離瓶底，漂浮于培養(yǎng)液中細(xì)胞的邊緣僵硬，細(xì)胞核輪廓欠清，細(xì)胞質(zhì)渾濁，透光性欠佳。

1.4肺癌動(dòng)物模型建立 將肺癌細(xì)胞離心制成細(xì)胞懸液(5×106)后，接種于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠注射0.2 mL。待移植瘤生長(zhǎng)至肉眼可見后，將成瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、抑制劑組，每組5只。模型組裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)；抑制劑組裸鼠皮下注射CD-839 20 mg/kg，1次/天，共2周，治療過(guò)程中模型組及抑制劑組均無(wú)死亡。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1MTT法檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞增殖情況 取各組細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置6、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，加入MTT溶液，孵育4 h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩10 min，使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)450～490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A值)，參比波長(zhǎng)為600～650 nm。以A值來(lái)反映其增殖情況。

1.5.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞凋亡 于96孔板中接種各組肺癌A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，采用乙二胺四乙酸的胰酶消化細(xì)胞，離心5 min，2 000 r/min，棄去上清液，PBS清洗，加入500 μL結(jié)合緩沖液，10 μL PI及5 μL AnnexinV-FITC，混勻，無(wú)光孵育5 min，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)所有細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

1.5.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞CD80、CD86、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)水平 于96孔板中接種各組肺癌A549細(xì)胞，24 h收集細(xì)胞，PBS清洗，加入10%山羊血清4 ℃無(wú)光孵育25 min，PBS清洗，1∶100比例加入PE anti-mouseCD80、FITCanti-mouseCD86、PerCP/Cy5.5anti-mouseI-A/I-E抗體，4 ℃無(wú)光孵育15 min后，加入1 mL流式緩沖液，充分洗滌。500 μL流式緩沖液重懸后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，復(fù)孔2次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4RT-qPCR檢測(cè)谷氨酸脫氫酶(GLUD1)、谷氨酰胺酶(GLS)mRNA水平 取各組肺癌A549細(xì)胞，25%胰蛋白酶消化后重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液防御試管中。Trizol提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，條件為42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，內(nèi)參為β-actin，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40個(gè)循環(huán)，計(jì)算方法用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.5αKGA測(cè)定試劑盒檢測(cè)αKGA水平 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，取各組肺癌A549細(xì)胞，離心20 min后收集上清液，4 ℃密封保存。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，在樣品孔中加入50 μL αKGA，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和樣品孔加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封閉1 h，祛除封閉液，清洗，無(wú)光孵育15 min，加入50 μL終止液，450 nm測(cè)定A值。

1.5.6檢測(cè)各組裸鼠瘤重 治療結(jié)束后，處死各組裸鼠，取出瘤體，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)，計(jì)算腫瘤體積(V=L×W2/2)。

2 結(jié) 果

2.1各組肺癌A549細(xì)胞增殖情況比較 培養(yǎng)6 h時(shí)各組肺癌A549細(xì)胞A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)24、48 及72 h時(shí)Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞A值高于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24、48 及72 h時(shí)Ⅱ組肺癌A549細(xì)胞A值高于Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24、48 及72 h時(shí)Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞A值與Ⅲ組比較，明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌A549細(xì)胞增殖情況比較

2.2肺癌A549細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞凋亡率分別為(3.02±0.39)%、(4.72±0.52)%、(7.95±0.84)%及(13.22±1.28)%。Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞凋亡率較Ⅱ組明顯降低(t=7.860，P<0.05)，Ⅱ組細(xì)胞凋亡率低于Ⅲ組(t=9.240，P<0.05)，與Ⅲ組相比，Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞凋亡率升高明顯(t=8.290，P<0.05)。

2.3各組肺癌A549細(xì)胞中T細(xì)胞CD80、CD86、MHCⅡ水平檢測(cè)結(jié)果 Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平低于Ⅱ組；Ⅱ組肺癌A549細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平低于Ⅲ組；與Ⅲ組相比，Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組肺癌A549細(xì)胞CD80、CD86、MHCⅡ水平對(duì)比

圖2 各組CD80、CD86、MHCⅡ水平對(duì)比

2.4各組肺癌A549細(xì)胞GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平檢測(cè)結(jié)果 Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞中GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅱ組(tGLUD1 mRNA=2.408，PGLUD1 mRNA=0.036；tGLS mRNA=2.930，PGLS mRNA=0.015)，Ⅱ組GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅲ組(tGLUD1 mRNA=2.341，PGLUD1 mRNA=0.041；tGLS mRNA=2.578，PGLS mRNA=0.027)，Ⅲ組GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平高于Ⅳ組(tGLUD1 mRNA=3.217，PGLUD1 mRNA=0.009；tGLS mRNA=2.408，PGLS mRNA=0.036)，見表4。

表4 各組肺癌A549細(xì)胞GLUD1 mRNA、GLS mRNA水平對(duì)比

2.5各組肺癌A549細(xì)胞中αKGA水平檢測(cè)結(jié)果 Ⅰ組肺癌A549細(xì)胞中αKGA水平(2.43±0.24)高于Ⅱ組(1.62±0.12)；Ⅱ組肺癌A549細(xì)胞中αKGA水平高于Ⅲ組(1.31±0.11)； Ⅳ組肺癌A549細(xì)胞中αKGA水平(1.03±0.09)與Ⅲ組比較，明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6GLUD1 mRNA、GLS mRNA、αKGA相關(guān)性分析 GLUD1 mRNA與GLS mRNA呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.001)，GLUD1 mRNA與αKGA呈正相關(guān)(r=0.708，P<0.001)。GLS mRNA與αKGA呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.001)。見圖3。

圖3 GLUD1 mRNA、GLS mRNA、αKGA相關(guān)性分析

2.7瘤體體積及質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 模型組裸鼠瘤體體積(208.33±14.28)mm3，瘤體質(zhì)量(1.42±0.66)g，均高于抑制劑組裸鼠瘤體體積(110.24±9.37)mm3，瘤體質(zhì)量(0.84±0.42)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組裸鼠瘤體體積對(duì)比

3 討 論

據(jù)有關(guān)報(bào)道統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病概率及死亡人數(shù)逐年增長(zhǎng)，且其預(yù)后較差，因此，對(duì)于肺癌的治療至關(guān)重要[11]。

靶向惡性腫瘤新陳代謝的治療是近年熱門的研究領(lǐng)域。Gln的代謝可促進(jìn)腫瘤發(fā)展，因此，抑制其水平發(fā)展成為了治療腫瘤的新方向。在本研究中提出，隨著CB-839濃度的增加，肺癌細(xì)胞的增殖逐漸降低，凋亡逐漸增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，且大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CB-839可抑制肺癌裸鼠移植瘤瘤體體積。廖英等[12]在研究谷氨酰胺酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)中提出，其可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。沈偉濤等[13]對(duì)肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中提出，CB-839通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，改善病情發(fā)展。本研究與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道結(jié)果相似。未成熟樹突狀細(xì)胞常呈現(xiàn)低表達(dá)的MHCⅡ，導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞適當(dāng)活化和調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)可以清除有害的病原體或腫瘤細(xì)胞。在腫瘤微環(huán)境中，由于受腫瘤免疫抑制影響，樹突狀細(xì)胞無(wú)法通過(guò)表達(dá)抗原肽復(fù)合物和共刺激分子，向毒性T淋巴細(xì)胞提供抗原活化信號(hào)，甚至進(jìn)一步促進(jìn)Treg的增殖，抑制T細(xì)胞殺傷效應(yīng)，CD80、CD86、MHCⅡ標(biāo)志著樹突狀細(xì)胞的成熟[14]。CB-839可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤氧化反應(yīng)及能量應(yīng)激提高免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)CB-839干預(yù)后肺癌細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ水平升高，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在張雪偉等[15]對(duì)肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究中提出，紅景天苷通過(guò)提高CD80、CD86、MHCⅡ水平，加快樹突狀細(xì)胞的成熟，清除癌細(xì)胞，改善病情發(fā)展。馬國(guó)峰[16]在對(duì)腎癌的實(shí)驗(yàn)中提出，Gln剝奪后通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞改善免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究與上述研究結(jié)果相似，因此本研究認(rèn)為，CB-839通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞，殺傷肺癌細(xì)胞，阻滯腫瘤發(fā)展。

綜上所述，CB-839可能通過(guò)介導(dǎo)T淋巴效應(yīng)提高CD80、CD86、MHCⅡ水平，抑制αKGA及Gln相關(guān)基因轉(zhuǎn)化，從而降低肺癌細(xì)胞活性，促進(jìn)其凋亡，為今后肺癌的臨床治療及新藥研發(fā)提供參考依據(jù)。