Th1/Th2、CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4在橋本甲狀腺炎患者外周血中的表達及與甲狀腺相關實驗室指標的相關性*

羅百文，李茂城，楊麗梅

廣東省惠州市中心人民醫院檢驗科，廣東惠州 516001

橋本甲狀腺炎(HT)作為一種自身免疫性疾病，其主要病理特征為甲狀腺存在大量淋巴細胞浸潤，因此其也是公認的器官特異性免疫疾病，可嚴重影響患者的生活質量。研究認為，HT與遺傳因素及患者自身免疫相關因素關系密切[1]。有研究顯示，HT的發病機制與輔助性T淋巴細胞(Th細胞)失衡等所致的免疫失衡存在明顯關系，主要表現為Th1細胞相關免疫反應上調，而Th2細胞相關免疫反應的作用尚不明確[2]。CD28、可誘導共刺激分子 (ICOS)、程序性死亡受體1(PD-1)和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)等共信號因子在調節機體內T淋巴細胞的活化、增殖、自我識別和免疫耐受，以及免疫介導的組織損傷中發揮了重要作用，可能在HT發病機制中和Th1細胞與Th2細胞比值(Th1/Th2)失衡有關，但仍然有待深入研究。本研究收集了2021年在本院門診或住院治療的HT患者和部分健康體檢者的外周血標本，通過檢測相關指標，研究HT患者外周血中CD3+CD4+T淋巴細胞表面的共信號分子(CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4)與Th1、Th2細胞相關細胞因子[γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-2、IL-4和IL-10]的表達情況，分析HT患者甲狀腺相關實驗室指標[甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、促甲狀腺激素(TSH)、游離甲狀腺素(FT4)及游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)]水平與IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4 水平是否存在相關性，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年在本院門診或住院治療的HT患者40例為HT組，另選擇同期健康體檢者40例為對照組。HT組男11例、女29例，年齡(45.0±8.3)歲；對照組男13例、女27例，年齡(43.9±9.2)歲。兩組研究對象性別和年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。HT組納入標準：(1)TSH、FT4及FT3等實驗室指標檢測提示甲狀腺功能低下；(2)血清TPOAb和抗甲狀腺球蛋白抗體檢測結果為陽性；(3)甲狀腺腺體彌漫性腫大或縮小，質地較韌；(4)超聲檢查提示甲狀腺腺體回聲減弱或紊亂，小片狀低回聲或伴有條索狀強回聲改變；符合(1)～(4)中兩項或以上，或病理學檢查提示慢性淋巴細胞性甲狀腺炎即納入研究。對照組納入標準：(1)超聲檢查提示甲狀腺腺體大小和質地正常；(2)甲狀腺自身免疫抗體檢測結果為陰性；(3)TSH、FT3和FT4等實驗室指標檢測提示甲狀腺功能正常。兩組排除標準：(1)近1年進行過放射性碘治療；(2)患有類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化等自身免疫性疾病；(3)患有傳染性疾病；(4)合并導致肝功能不全、心功能不全、腎功能不全的系統性慢性疾病；(5)正在服用抗甲狀腺藥物或進行甲狀腺激素替代治療。本研究已通過本院醫學倫理委員會審查，入組研究對象均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平檢測 采集所有納入的HT患者和健康體檢者外周血5 mL，室溫靜置后離心分離血清，將血清標本保存于-70 ℃冰箱待檢。采用貝克曼庫爾特公司生產的全自動化學發光免疫分析儀及配套試劑進行檢測，所有操作均嚴格按照說明書要求完成。

1.2.2血清IFN-γ、 IL-2、IL-4和 IL-10水平檢測 將上述保存的血清標本采用酶聯免疫吸附試驗檢測IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。

1.2.3流式細胞儀檢測外周血中Th1、Th2細胞 (1)標本采集：按照標準方法采用肝素鈉抗凝真空采血管采集研究對象外周血2 mL，保存于4 ℃冰箱，2 h內進行標本處理。(2)胞外染色：取300 μL抗凝血于無菌干燥離心管中并加入20 μL CD4-PC5單克隆抗體，振蕩混勻后置于室溫條件下避光孵育30 min，加入3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心棄去上清液。(3)細胞培養：分別加入935 μL RPMI 1640培養液、20 μL 2 μg/mL的Ionomycin工作液、10 μL 1 μg/mL的PMA工作液和35 μL 3.5 μg/mL的Monensin工作液，構成總體積為1 mL的細胞刺激培養體系。振蕩混勻后置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育5 h后取出，加入3 mL PBS，離心棄去上清液；重復以上操作1次。(4)固定破膜：加入100 μL固定劑，振蕩混勻后置于室溫條件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，離心棄去上清液；然后加入l00 μL破膜劑振蕩混勻后置于室溫條件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，離心棄去上清液。(5)胞內染色：加入20 μL抗人IFN-γ-FITC單克隆抗體和 20 μL抗人IL-4-PE單克隆抗體后振蕩混勻,對細胞內的細胞因子IFN-γ和IL-4進行特異性染色；置于室溫條件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，離心棄去上清液。(6)上機檢測：加入600 μL PBS重懸細胞，30 min內使用流式細胞儀進行檢測，以CD4+IFN-γ+T淋巴細胞表示Th1細胞，以CD4+IL-4+T淋巴細胞表示Th2細胞，同時設置同型對照和陰性對照。

1.2.4流式細胞儀檢測外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平 所有研究對象均于清晨空腹采集外周血標本2 mL，室溫下乙二胺四乙酸抗凝，及時(6 h內)采用流式細胞儀檢測。取4支流式管，依次標注CD28、ICOS、PD-1及CTLA-4，各管均加入CD3 APC 3 μL、CD4 PerCP 5 μL、CD8 FITC 5 μL，然后依次向各管加入CD28 PE、ICOS PE、PD-1 PE、CTLA-4 PE各5 μL，加入研究對象新鮮外周血標本50 μL。將所有流式管置于振蕩器上輕微振蕩后室溫下避光孵育20 min。將各管取出，加入紅細胞裂解液(每10 μL標本加入0.4～0.5 mL)。再次室溫下避光孵育10 min后置于離心機內，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液后置于振蕩器上輕微振蕩，各管加入PBS 1 mL。用流式細胞儀進行檢測(每份標本至少收集 20 000個T淋巴細胞進行分析)，用流式細胞儀自帶軟件分析外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面所表達的CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平，其表達水平用其占CD3+CD4+T淋巴細胞的比例表示。

2 結 果

2.1兩組血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平比較 HT組血清FT4和TPOAb水平均明顯高于對照組，而FT3、TSH水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平比較

2.2兩組外周血中Th1細胞、Th2細胞、Th1/Th2及相關細胞因子水平比較 HT組外周血中Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ和IL-2水平明顯高于對照組，Th1/Th2也明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組外周血中Th2細胞及其相關細胞因子IL-4和IL-10水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組外周血中Th1細胞、Th2細胞、Th1/Th2及相關細胞因子水平比較

2.3兩組外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平比較 HT組外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28、ICOS和PD-1水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組CTLA-4水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平比較

2.4HT患者各指標間相關性分析結果 FT4水平與Th1細胞、Th1/Th2水平呈正相關(P<0.05)；TSH水平與Th1細胞、Th1/Th2和IL-2水平呈負相關(P<0.05)；TPOAb水平與Th1細胞、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2、CD28及ICOS水平呈正相關(P<0.05)；PD-1水平與Th1細胞、Th1/Th2、IFN-γ、CD28、ICOS水平呈正相關(P<0.05)；CD28及ICOS水平與Th1細胞、Th1/Th2、IFN-γ及IL-2水平呈正相關(P<0.05)；其余指標之間水平無相關性(P>0.05)，見表4。

表4 HT患者各指標間相關性分析結果(r)

3 討 論

HT患者的甲狀腺中大量浸潤的T淋巴細胞主要包括Th細胞、細胞毒性T淋巴細胞(Tc)和調節性T淋巴細胞3種類型[3]。未致敏的Th細胞(Th0細胞)致敏后主要分化為以分泌IFN-γ和IL-2等為主的Th1細胞和以分泌IL-4和IL-10等為主的Th2細胞。其中Th1細胞及其分泌的細胞因子在細胞免疫效應過程中發揮重要作用，而Th2細胞及其分泌的細胞因子則在體液免疫效應過程中發揮重要作用，同時Th1細胞分泌的細胞因子會抑制Th2細胞的增殖，而Th2細胞分泌的細胞因子則會抑制Th1細胞的增殖。因此，Th1/Th2的動態平衡是機體內環境穩定的重要保證，其失衡是自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤等多種疾病發生的重要原因，目前普遍認為HT也可能與Th1/Th2失衡有關。從本研究的結果來看，HT組Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ和IL-2水平較對照組明顯升高(P<0.05)，而Th2細胞及其相關細胞因子IL-4和IL-10水平略低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，這進一步明確了Th1細胞及其相關細胞因子在HT發病機制中的重要作用，而Th2細胞及其相關細胞因子參與HT免疫應答反應的作用尚不明確，這與一些研究的結論相似[4-5]。

TPOAb是HT的自身特異性抗體，主要由微粒體合成，當其釋放入血后與相應抗原結合，可激活補體并增強T淋巴細胞毒性，從而導致甲狀腺功能損害加重，是造成甲狀腺濾泡破壞的重要原因；同時TPOAb還可作為HT診斷和病情評估的特異性參考指標[6]。而FT4和TSH是診斷HT和評估HT患者甲狀腺功能變化的重要指標。本研究中，FT4和TPOAb水平與Th1細胞、Th1/Th2水平呈正相關(P<0.05)，TSH水平與Th1細胞、Th1/Th2水平呈負相關(P<0.05)，此外，TPOAb水平與Th1細胞相關細胞因子IFN-γ和IL-2水平也呈正相關(P<0.05)，TSH水平與IL-2水平呈負相關(P<0.05)；而TPOAb、TSH、FT4水平均與Th2細胞及其相關細胞因子IL-4和IL-10水平無相關性(P>0.05)，更進一步明確了Th1細胞及其相關細胞因子與HT發病的密切關系。

有研究表明，激活的T淋巴細胞在自身免疫性疾病，如類風濕關節炎等疾病的慢性炎癥過程中起重要作用[7]，而CD28和ICOS等表達的共刺激信號又是T淋巴細胞活化的關鍵因素[8]。因此，在一些自身免疫性疾病，如類風濕關節炎[9]、系統性紅斑狼瘡[10]等患者外周血單個核細胞中CD28、ICOS的表達上調。本研究中，HT患者外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28和ICOS水平較健康體檢者也明顯升高，與上述研究結論相似。Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ和IL-2等上調是自身免疫性疾病中慢性炎癥發生的重要原因之一，本研究中，CD28和ICOS水平與Th1/Th2、Th1細胞、IFN-γ和IL-2水平呈正相關(P<0.05)，表明在HT的發病過程中CD28和ICOS可能促進了Th0細胞分化向Th1細胞偏移。另外，本研究中CD28和ICOS水平還與TPOAb水平呈正相關(P<0.05)，表明CD28和ICOS水平可能在HT的發病機制中發揮了重要作用，但具體機制還需要進行深入研究。

PD-1作為一種抑制性受體，主要表達于活化的T淋巴細胞、自然殺傷細胞、B淋巴細胞和單核細胞中[11]，目前發現其在類風濕關節炎[9]、系統性紅斑狼瘡[10]等自身免疫性疾病患者的T淋巴細胞表面也高表達，發揮著下調免疫反應的作用，是機體對自身炎癥反應的一種負調節因子。本研究中，HT患者外周血CD3+CD4+T淋巴細胞表面PD-1水平較健康體檢者明顯升高，分析其機制可能為HT患者持續的 T淋巴細胞活化和過度產生的促炎細胞因子是免疫系統的危險信號，機體通過選擇性上調負性共信號分子的表達而進行負反饋調節。CTLA-4是CD28的生理拮抗劑，與PD-1均屬于共抑制分子，其主要功能為下調T淋巴細胞的免疫反應[12]。本研究中，CTLA-4水平在HT患者與健康體檢者中比較，差異無統計學意義(P>0.05)，其可能原因為 CTLA-4在外周血中的表達水平相對較低，用流式細胞儀檢測單個核細胞呈現出不敏感性。有研究顯示，HT可能與CTLA-4基因多態性所導致的基因產物表達功能缺失有關，進而導致T淋巴細胞負調控出現障礙[13]。因此，要探明CTLA-4與HT的內在聯系，還應該從甲狀腺細胞的角度通過動物實驗展開深入研究。

綜上所述，HT患者外周血中Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ和IL-2水平較健康體檢者均明顯上調，其CD3+CD4+T淋巴細胞表面CD28、ICOS和PD-1的表達也均明顯上調。因此，Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ和IL-2，以及CD28、ICOS和PD-1可能在HT的發病機制中發揮了重要作用。