Leptin與CXCL4在阿爾茨海默病發展進程中的作用研究*

田 甜，韋 靜，呂宏祥

1.南京醫科大學附屬江寧醫院神經內科，江蘇南京 211100；2.南京醫科大學附屬南京醫院檢驗科，江蘇南京 211100；3.南京醫科大學附屬江寧醫院檢驗科，江蘇南京 211100

阿爾茨海默病(AD)是老年人群進行性癡呆的最常見病因，AD的組織學特點是β淀粉樣蛋白(Aβ)在細胞外斑塊上沉積，以及在細胞內神經纖維纏結中過度磷酸化tau蛋白聚積[1-3]。研究表明，AD患者中肥胖可能先于癡呆出現，并且會引起瘦素(Leptin)和胰島素抵抗[4]。Leptin是一種在脂肪組織中合成的肽激素，其可以通過自分泌、旁分泌和內分泌的作用機制去影響外周和中樞神經系統的自我保護過程；Leptin的生物學活性主要依賴表達于各個組織器官的表面受體，其在維持葡萄糖穩態、免疫穩態、血管生成、造血、生殖中均發揮重要的作用[4]。AD作為一種慢性神經退行性疾病，各種炎癥反應和細胞因子也參與其發展進程，亦有數據證實巨噬細胞作為高度異質性的細胞群體，根據局部微環境的改變其可進行自身功能重塑(極化為M1/M2型巨噬細胞)，參與AD的發展進程[5]。研究發現，CXC趨化因子配體4(CXCL4)作為一種由活化血小板和免疫細胞產生的趨化因子，可參與腫瘤[6]、感染[7]和炎癥反應相關疾病(系統性硬化癥、類風濕關節炎和銀屑病關節炎)[8]等的進展。目前，Leptin與CXCL4在腫瘤、炎癥反應相關疾病中的作用及與這些疾病關系的報道較少。本研究以AD患者作為研究對象，探討Leptin與CXCL4在AD發展進程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1-4月在南京醫科大學附屬江寧醫院住院的AD患者30例為AD組，其中男20例，女10例；平均年齡(76.43±2.20)歲。納入標準：年齡60～95歲；血尿便常規、肝腎功能等均無異常。另選擇同期60～95歲的健康體檢者10例為健康對照組，其中男4例，女6例；平均年齡(75.50±3.79)歲。AD組與健康對照組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 人磷酸化tau-181蛋白(p-tau-181)檢測試劑盒、人β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)檢測試劑盒(深圳市安群生物工程有限公司)，Leptin、CXCL4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)，cDNA反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，CXCL4單克隆抗體(美國Proteintech公司)，CXCL4引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，DMEM培養基、胎牛血清(以色列 Biological Industries公司)。Jet-iStar 3000免疫分析儀(中翰盛泰生物技術股份有限公司)，凝膠電泳儀、全自動酶聯免疫分析儀(美國Bio-Rad公司)，PCR擴增儀、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)擴增儀(美國ABI公司)，電泳凝膠成像分析系統(美國阿爾法公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。小鼠RAW264.7巨噬細胞系購自ATCC細胞庫。

1.3方法

1.3.1臨床資料收集 收集AD組與健康對照組體質量、血葡萄糖(Glu)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)等臨床資料。

1.3.2標本收集 采用促凝管收集AD組與健康對照組外周血2 mL，靜置10～20 min后放置于低速臺式離心機中以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存待測，避免反復凍融。

1.3.3細胞培養與處理 小鼠RAW264.7巨噬細胞系在37 ℃、5%CO2培養條件下培養，正常換液與傳代，選取對數生長期的細胞鋪板，分別設置對照組(不進行任何處理)與處理組(用50 ng/mL Leptin處理)，在處理6、12 h時收集細胞用于相關檢測。

1.3.4ELISA檢測血清Aβ1-42、p-tau-181、Leptin及CXCL4表達水平 將收集的研究對象血清標本吸取100 μL加入反應孔中，37 ℃溫育60 min后棄去反應孔中液體，加入洗滌液洗板5次，拍干后每孔加入100 μL結合抗體，37 ℃溫育30 min，洗板拍干后加入100 μL辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，用封口膜封板，37 ℃溫育30 min，用洗滌液反復洗5次，分別加入底物顯色，15 min后加入終止液，用酶標儀(450 nm)進行檢測。

1.3.5蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測巨噬細胞CXCL4蛋白表達水平 收集對照組與處理組Leptin處理6、12 h的小鼠巨噬細胞于1.5 mL的EP管中，1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并洗滌細胞3次，每次5 min，隨后加入含有1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液RIPA，充分裂解后12 000×g離心5 min，收集上清液并以4∶1的比例加入5×loading buffer后置于金屬浴中100 ℃ 10 min。使用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離不同分子量的蛋白，并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%胎牛血清清蛋白室溫封閉1 h，CXCL4(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后用1×TBST洗滌3次，每次10 min，用HRP標記的羊抗小鼠或兔二抗室溫孵育1 h。β-actin作為內參(1∶5 000)，最后加入ECL發光液觀察目的蛋白的表達。

1.3.6RT-qPCR檢測巨噬細胞CXCL4 mRNA表達水平 收集對照組與處理組Leptin處理6、12 h的小鼠巨噬細胞于1.5 mL的EP管中，1 mL PBS重懸并洗滌細胞3次，每次5 min，隨后加入Trizol Reagent提取總RNA，根據說明書反轉錄成cDNA，采用RT-qPCR檢測CXCL4 mRNA表達水平，以GAPDH作為內參。擴增條件：95 ℃預變性15 s， 95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。CXCL4 mRNA的相對表達水平用2-ΔΔCt法計算。

2 結 果

2.1AD組與健康對照組臨床資料比較 AD組體質量、Glu、HDL、LDL、TG水平與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2AD組與健康對照組血清Aβ1-42、p-tau-181表達水平比較 AD組血清Aβ1-42表達水平為(225.6±20.78)pg/mL，p-tau-181表達水平為(39.80±2.10)pg/mL，均明顯高于健康對照組的Aβ1-42[(52.64±7.92)pg/mL]、p-tau-181[(15.01±1.75)pg/mL]表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1A、1B。

表1 AD組與健康對照組臨床資料比較

注：A為AD組與健康對照組血清Aβ1-42表達水平比較；B為AD組與健康對照組血清p-tau-181表達水平比較；兩組比較，*P<0.05。

2.3AD組與健康對照組血清Leptin、CXCL4表達水平比較 AD組血清Leptin表達水平為(186.1±15.03)pg/mL，CXCL4表達水平為(99.41±11.07)pg/mL，均明顯低于健康對照組Leptin[(283.2±13.71)pg/mL]、CXCL4[(151.0±25.95)pg/mL]表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A、2B。

注：A為AD組與健康對照組血清Leptin表達水平比較；B為AD組與健康對照組血清CXCL4表達水平比較；兩組比較，*P<0.05。

2.4Leptin調控巨噬細胞中CXCL4的表達 與對照組比較，處理組Leptin處理6、12 h能明顯上調CXCL4蛋白表達水平，處理6 h能明顯上調CXCL4 mRNA表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3A、3B。

注：A為對照組與處理組Leptin處理6、12 h的CXCL4蛋白表達水平比較；B為對照組與處理組Leptin處理6、12 h的CXCL4 mRNA表達水平比較；與對照組比較，*P<0.05。

2.5AD患者血清Leptin表達水平與CXCL4表達水平的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，AD患者血清Leptin表達水平與CXCL4表達水平呈正相關(r=0.445，P<0.05)。見圖4。

圖4 AD患者血清Leptin表達水平與CXCL4表達水平的相關性

3 討 論

AD最初的癥狀是與海馬病變相關的情景性記憶喪失[9]。但近年來研究也發現，一些與肥胖相關的病理改變，如神經性炎癥、胰島素抵抗或線粒體功能障礙也可以出現在AD的病理進程中[10]。流行病學研究中也同樣有證據表明，體質量變化與AD有關，中年肥胖增加了AD的發生風險，且在AD早期階段患者存在體質量減輕[11]。本研究對納入的AD組和健康對照組的臨床資料進行比較，兩組體質量、Glu、HDL、LDL、TG水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示納入的AD患者不存在其他指標異常導致的AD進展。

Leptin是一種由脂肪細胞合成和分泌的激素，主要由白色脂肪組織分泌，少量由棕色脂肪組織分泌[12]。Leptin通過血腦屏障后作用于下丘腦，發揮調節進食行為和能量消耗的作用。研究表明，Leptin對海馬的發育和功能影響較明顯，Leptin可以促進海馬突觸的可塑性，包括促進神經發生和突觸傳遞[11]。此外，在衰老和AD的動物模型中也發現，通過喂養和鍛煉來維持脂肪組織中的能量平衡，可以改善認知功能并防止與年齡相關的學習能力下降[13]；也有研究表明，Leptin的神經保護活性主要表現在其可通過抑制淀粉樣蛋白的生成，降低tau蛋白的磷酸化水平來改善認知功能[14]。Leptin除了在調節系統代謝和食欲方面具有良好的作用外，在免疫細胞功能調節中也同樣發揮關鍵作用，如許多免疫細胞(T、B淋巴細胞及巨噬細胞等)已經被證明可以直接通過與其表面的Leptin受體結合發揮生物學活性，進而參與腫瘤、病毒感染及自身免疫性疾病的發生[15]。巨噬細胞作為一群功能異質性的細胞群體參與多種炎癥反應相關疾病的發展進程，而AD作為一種慢性神經退行性疾病，各種炎癥反應參與其病理變化。已有報道顯示，AD患者中M2b型巨噬細胞亞群的減少會下調其認知功能，同時本課題組前期研究也發現Leptin能夠調節巨噬細胞功能重塑，參與自身免疫性心肌炎的發展進程[16]。由此推測，Leptin能夠調節巨噬細胞向M2型極化，參與AD的發展。

CXCL4又稱血小板因子，是最早被發現的趨化因子家族成員，其儲存在血小板分泌的顆粒中，在蛋白激酶C和Rac1激活時釋放[6]。研究顯示，CXCL4具有一定的趨化功能，且參與自身免疫性疾病、腫瘤及炎癥反應相關疾病的發生[7-8]，而關于CXCL4在AD發展進程中的作用報道較少。本研究發現，AD患者血清Leptin表達水平降低的同時伴有CXCL4表達水平的降低，并且本研究在細胞水平證實了Leptin能夠調節CXCL4的表達。由此說明，Leptin能夠通過調節CXCL4的表達在AD發展進程中發揮重要作用。

綜上所述，AD患者血清Aβ1-42、p-tau-181表達水平升高，Leptin、CXCL4表達水平降低，Leptin能夠調控CXCL4的表達。在接下來的研究中本課題組將進一步探討在AD發展進程中Leptin調控CXCL4表達的具體機制，以期為AD患者的治療提供新的思路。