子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α表達水平及其與細胞侵襲、上皮間質轉化的相關性

曹 偉

江西省南昌市南昌縣人民醫院婦產科，江西南昌 330200

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的良性腫瘤，且近年來其發病率逐年升高，發病人群趨于年輕化[1]。目前認為子宮肌瘤是一種雌激素依賴性腫瘤，雌激素水平過高可刺激細胞增殖、侵襲，但相關機制仍未完全明確[2]。低氧是實體腫瘤生存的微環境所具有的特征，而低氧誘導因子-1α(HIF-1α)是引起細胞低氧反應的關鍵核轉錄因子，可能參與子宮肌瘤發生、發展[3]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，調控細胞生長、增殖、凋亡等各種生理過程。研究表明，多種miRNA參與子宮肌瘤發生、發展過程[4]。miR-23是目前研究者們關注的焦點，研究顯示，子宮肌瘤組織中miR-23呈低表達，可能參與子宮肌瘤的發生，但相關機制尚未完成明確[5]。基于此，本研究探討了子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α的表達水平及其與細胞侵襲、上皮間質轉化(EMT)的相關性，旨在為子宮肌瘤發生、發展的機制研究提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年1月于本院行手術切除治療的子宮肌瘤患者84例為研究對象，收集其切除的子宮肌瘤組織和正常肌層組織進行研究。納入標準：經術后病理檢查證實為子宮肌瘤；增生期患者，月經周期規律。排除標準：術前3個月使用過激素類藥物；合并甲狀腺功能減退或亢進癥、糖尿病；合并心、肝、腎功能不全；合并卵巢腫瘤。患者年齡35～54歲，平均(47.28±5.84)歲。

1.2方法 術中收集子宮肌瘤組織及距子宮肌瘤0.5 cm以上的適量正常肌層組織，于-80 ℃冰箱儲存。(1)miR-23、HIF-1α mRNA表達水平檢測。采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)進行檢測，取適量標本，采用Trizol法提取組織總RNA(試劑盒購自上海名勁生物科技有限公司)，將總RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR反應以U6為內參，U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23上游引物5′-TCACACTATATCACATTGCCAGG-3，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；HIF-1α mRNA上游引物5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3′，下游引物5′-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3′，結果采用2-ΔΔCt法進行計算。(2)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達情況檢測。組織標本常規石蠟包埋切片，采用免疫組織化學法檢測ER、PR表達情況，采用Sinicrope改良法進行結果判斷，表達評分=染色細胞計數評分×染色強度評分，陰性：表達評分≤1分；弱陽性：表達評分2～3分；中度陽性：表達評分4～5分；強陽性：表達評分≥6分。(3)增殖基因、凋亡基因、侵襲基因、EMT標志基因表達水平檢測。取適量標本，提取組織總蛋白，采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測增殖基因[B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)]、凋亡基因[Bcl-2相關X蛋白(Bax)]、侵襲基因[基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9]、EMT標志基因[N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)]表達水平，將每毫克總蛋白中上述基因蛋白層面的表達水平作為其表達水平。

1.3觀察指標 (1)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平及ER、PR陽性率。(2)比較不同ER、PR表達情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平。(3)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織增殖、凋亡基因表達水平。(4)分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與增殖、凋亡基因表達水平的相關性。(5)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織侵襲基因、EMT標志基因表達水平。(6)分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與侵襲基因、EMT標志基因表達水平的相關性。

2 結 果

2.1子宮肌瘤組織與正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平及ER、PR陽性率比較 子宮肌瘤組織miR-23表達水平低于正常肌層組織，HIF-1α mRNA表達水平及ER、PR陽性率高于正常肌層組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平及ER、PR陽性率比較

2.2不同ER、PR表達情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平比較 ER、PR陽性子宮肌瘤組織miR-23表達水平分別低于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，HIF-1α mRNA表達水平分別高于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 不同ER表達情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1αmRNA表達水平比較

表3 不同PR表達情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平比較

2.3子宮肌瘤組織與正常肌層組織增殖、凋亡基因表達水平比較 子宮肌瘤組織Bcl-2表達水平高于正常肌層組織，Bax表達水平低于正常肌層組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 子宮肌瘤組織與正常肌層組織增殖、凋亡基因表達水平比較

2.4子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與增殖、凋亡基因表達水平的相關性 子宮肌瘤組織miR-23表達水平與Bcl-2表達水平呈負相關(P<0.05)，與Bax表達水平呈正相關(P<0.05)；子宮肌瘤組織HIF-1α mRNA表達水平與Bcl-2表達水平呈正相關(P<0.05)，與Bax表達水平呈負相關(P<0.05)，見表5。

表5 子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與增殖、凋亡基因表達水平的相關性

2.5子宮肌瘤組織與正常肌層組織侵襲基因、EMT標志基因表達水平比較 子宮肌瘤組織MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平高于正常肌層組織，E-cadherin表達水平低于正常肌層組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 子宮肌瘤組織與正常肌層組織侵襲基因、EMT標志基因表達水平比較

2.6子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與侵襲基因、EMT標志基因表達水平的相關性 子宮肌瘤組織miR-23表達水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平呈負相關(P<0.05)，與E-cadherin表達水平呈正相關(P<0.05)；子宮肌瘤組織HIF-1α mRNA表達水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平呈正相關(P<0.05)，與E-cadherin表達水平呈負相關(P<0.05)，見表7。

表7 子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與侵襲基因、EMT標志基因表達水平的相關性

3 討 論

子宮肌瘤可引起月經周期紊亂、痛經、盆腔壓迫癥狀及生育能力低下，極大危害女性生殖健康和生活質量[6]。子宮肌瘤屬于激素依賴性腫瘤，但至今其確切發病機制仍未完全闡明。因此，積極探索子宮肌瘤的發病機制，尋找有效的治療靶點具有重要的臨床價值。

miRNA屬于非編碼小RNA，通過結合下游靶基因使其沉默，進而在轉錄后精密調控下游靶蛋白。本研究利用RT-qPCR檢測子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23表達水平，結果顯示，子宮肌瘤組織miR-23表達水平明顯低于正常肌層組織，提示miR-23是在子宮肌瘤組織中表達明顯失調的miRNA之一，與劉烜等[7]的研究結果一致。孕激素是誘發子宮肌瘤的重要內分泌因素，孕激素通過特異性結合PR，激活核內調節基因表達，參與子宮肌瘤的發生。有學者用Targetscan軟件預測發現，PR基因是miR-23的靶基因之一[8]。且研究顯示，子宮肌瘤組織中miR-23表達水平與PR亞型蛋白PRA表達水平呈負相關[9]，這可能是miR-23參與子宮肌瘤發生與發展的重要機制。在腫瘤組織微環境中缺氧普遍存在，HIF-1α是HIF-1亞單位，具有氧調節作用，在缺氧、炎癥反應等情況下，其通過缺氧反應元件調控細胞凋亡、血管形成等生物學過程，增強機體對刺激的適應性[10]。有研究報道，HIF-1α mRNA在子宮肌瘤患者血清與組織中呈高表達，可能成為子宮肌瘤的潛在標志物[11-12]。本研究也發現類似結論，提示在子宮肌瘤發生、發展過程中，HIF-1α可能起重要作用。結合分子生物學功能，推測高表達的HIF-1α可能通過調控腫瘤血管生成、細胞凋亡、能量代謝等影響細胞增殖，進而引起子宮肌瘤的發生。雌、孕激素對子宮肌瘤生長具有促進作用，ER、PR與雌、孕激素親和力高，可選擇性保留較高水平雌、孕激素，加強其生物學效應[13]。本研究進一步分析發現，ER、PR陽性子宮肌瘤組織miR-23表達水平分別低于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，HIF-1α mRNA表達水平分別高于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，提示子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α的表達與ER、PR有關。進一步說明miR-23、HIF-1α在子宮肌瘤發展中發揮作用。

多種增殖、凋亡基因在子宮肌瘤細胞增殖過程中起重要的調節作用。Bcl-2可通過線粒體途徑使細胞生存時間延長，并增強細胞耐受外界刺激的能力，進而促進細胞增殖；Bax與Bcl-2是同源蛋白質，二者功能相互拮抗[14]。本研究顯示，子宮肌瘤組織Bcl-2表達水平高于正常肌層組織，Bax表達水平低于正常肌層組織，與既往研究結果一致[15]，提示增殖、凋亡基因異常表達與子宮肌瘤形成密切相關。進一步分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達水平與上述基因的相關性發現，miR-23表達水平與Bcl-2表達水平呈負相關(P<0.05)，與Bax表達水平呈正相關(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達水平與Bcl-2表達水平呈正相關(P<0.05)，與Bax表達水平呈負相關(P<0.05)。因此，推測子宮肌瘤組織miR-23低表達、HIF-1α mRNA高表達可能通過促進增殖基因表達、抑制凋亡基因表達而參與子宮肌瘤的發生與發展。

子宮肌瘤細胞侵襲性生長是引起子宮肌瘤病灶生長的關鍵環節[16]。MMP是導致細胞外基質降解與重構的主要酶類，其中MMP2、MMP9是降解Ⅳ型膠原酶的主要酶[17]。同時，細胞侵襲性生長還與EMT有關。EMT形成過程中，細胞由上皮表型轉化為間質表型，細胞間極性降低，且細胞運動特性增強，利于細胞侵襲[18]。N-cadherin、E-cadherin分別是間質表型、上皮表型細胞標志分子，與EMT密切相關[19]。本研究顯示，子宮肌瘤組織MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平高于正常肌層組織，E-cadherin表達水平低于正常肌層組織，提示MMP高表達及EMT加劇與子宮肌瘤發生和發展密切相關。進一步分析發現，子宮肌瘤組織miR-23表達水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平呈負相關(P<0.05)，與E-cadherin表達水平呈正相關(P<0.05)；HIF-1α mRNA表達水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達水平呈正相關，與E-cadherin表達水平呈負相關(P<0.05)，說明子宮肌瘤組織miR-23低表達、HIF-1α mRNA高表達可促進MMP表達及EMT，促進細胞侵襲。

綜上所述，miR-23低表達、HIF-1α高表達可能通過促進ER、PR高表達，細胞增殖、侵襲及EMT參與子宮肌瘤發生與發展。但miR-23、HIF-1α參與子宮肌瘤發生、發展的機制尚未完全闡明，如何相互促進、何為始發因素等問題仍有待后續研究進一步明確。