牙鲆TAK1基因的表達(dá)分析及免疫功能探究?

李恒順，司 瑜，王宣剛，曲江波，王志剛，劉金相,2,3，張全啟,2,3，于海洋??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)三亞海洋研究院 海南省熱帶水產(chǎn)種質(zhì)重點實驗室，海南 三亞 572000；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(Transforming growth factor β-activated kinase 1, TAK1)又稱絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7, MAP3K7)，屬于絲氨酸/蘇氨酸(Serine/threonine)蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的重要成員[1]。作為細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號分子，TAK1基因可以響應(yīng)外界各種刺激信號，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2-3]。TAK1基因于1995年首次在轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路中被發(fā)現(xiàn)，最初被鑒定為TGF-β信號通路中激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可被TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)激活[4]。隨后的研究表明，TAK1也是免疫信號傳導(dǎo)和促炎細(xì)胞因子通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，可被多種免疫刺激信號分子激活，包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、B和T細(xì)胞受體(BCR和TCR)配體以及 Toll 樣受體(TLR)配體(LPS、病毒ssRNA、dsRNA和DNA等)[3,5]。TAK1通過激活多種信號通路(如TGF-β/BMP、Wnt/Fz、JNK和NF-κB通路等)，在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)褶皺形態(tài)發(fā)生、血管發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[6-8]。其中，關(guān)于TAK1對促炎和先天免疫信號通路的調(diào)節(jié)作用已被廣泛研究。當(dāng)細(xì)胞受到外界病原體等刺激后，位于上游的TRAF2和TRAF6通過形成K63連接的多聚泛素鏈來誘導(dǎo)TAK1的激活，隨后激活的TAK1 通過分別磷酸化激活I(lǐng)κB激酶(IKK)復(fù)合物和MAPKs(ERK、JNK、p38 MAPK)來介導(dǎo)核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)轉(zhuǎn)錄因子的激活，使NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，從而激活下游促炎細(xì)胞因子基因(TNF-α、IL-1β、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)等)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[3,5,9]。同樣，部分硬骨魚中的研究也表明TAK1具有一定的免疫功能。如Zhao F等發(fā)現(xiàn)TAK1參與了草魚(Ctenopharyngodonidella)抵抗小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染的先天免疫防御過程[10]；Li Y W等克隆鑒定了斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)TAK1基因，并發(fā)現(xiàn)其對TLR信號通路具有負(fù)調(diào)控作用[11]；Jang J H等發(fā)現(xiàn)在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)RTH-149細(xì)胞中敲降TAK1能夠顯著阻斷由LPS誘導(dǎo)的p38 MAPK和JNK的磷酸化，并可顯著下調(diào)由LPS誘導(dǎo)的MAPKs和NF-κB下游炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)[12]。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬硬骨魚綱鰈形目牙鲆科牙鲆屬，是中國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種，近年來高密度的集約化養(yǎng)殖使得牙鲆易受細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體的感染，嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[13-15]。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)屬革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生致病菌，是一種牙鲆養(yǎng)殖過程中常見的致病菌，能夠引起牙鲆的腹水病和出血性敗血癥，嚴(yán)重危害牙鲆的健康生存[16-18]。與哺乳動物不同，作為變溫、低等脊椎動物，先天免疫系統(tǒng)在硬骨魚免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著主要作用[19-21]。因此在基因?qū)用鎸ρ丽业拿庖呦到y(tǒng)和免疫反應(yīng)機制進(jìn)行深入研究，可以針對不同類型的病原體制定出相應(yīng)的有效對策，避免因藥物濫用而導(dǎo)致耐藥菌出現(xiàn)、魚制品中抗生素殘留和水體環(huán)境污染等不良后果[22]，這將有助于牙鲆疾病的進(jìn)一步防治，減少養(yǎng)殖過程中的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究以牙鲆為研究對象，鑒定克隆了牙鲆TAK1基因(PoTAK1)，對其序列特征、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析；通過qRT-PCR檢測了PoTAK1在健康牙鲆各組織的分布情況；進(jìn)行了牙鲆鰓細(xì)胞系體外免疫刺激實驗和成體牙鲆體內(nèi)攻毒實驗，并通過qRT-PCR檢測了PoTAK1在刺激后的表達(dá)變化情況；通過亞細(xì)胞定位檢測了PoTAK1在細(xì)胞中的表達(dá)位置；通過雙螢光素酶報告實驗探究了PoTAK1對MAPK通路下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用；最后通過體外免疫調(diào)節(jié)檢測實驗探究了過表達(dá)PoTAK1對AP-1下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。本研究為更好地理解PoTAK1在牙鲆抵御病原體感染時發(fā)揮的免疫反應(yīng)機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中所用牙鲆由海陽市黃海水產(chǎn)有限公司提供，體長320～420 mm，體重500～700 g。實驗前，將上述牙鲆置于海水中馴養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間保持水溫18～20 ℃，pH 7.9～8.1，鹽度28～30，光周期12 h光照12 h黑暗(12L∶12D)，氨氮濃度(0.13 ± 0.05)mg/L，溶解氧濃度(7.95 ± 0.50)mg/L。每天用商業(yè)飼料投喂2次，每隔一日換水一次。

本實驗中所用遲緩愛德華氏菌由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所贈予。實驗前將該菌株在LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

本實驗室中所用牙鲆鰓細(xì)胞系(FG9307)和HEK-293T細(xì)胞系由中國海洋大學(xué)細(xì)胞工程技術(shù)實驗室贈予。使用DMEM/F12培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1%MEM非必需氨基酸溶液)培養(yǎng)牙鲆鰓細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為24 ℃。使用DMEM培養(yǎng)基(10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% MEM非必需氨基酸溶液)培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2 實驗試劑

1.3 PoTAK1基因核心片段的獲取

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensemble(http://www.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫中檢索得到斑馬魚(Daniorerio)和半滑舌鰨(Cynoglossussemi-laevis)TAK1的核酸序列，將這些序列與本實驗室已有的牙鲆基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行本地BLAST(e值為1×10-5)，獲得牙鲆TAK1基因序列，將獲得的牙鲆TAK1基因序列與NCBI和Ensemble數(shù)據(jù)庫中牙鲆TAK1基因序列進(jìn)行比較，最終確定牙鲆TAK1基因序列，隨后使用IDT(https://sg.idtdna.com/pages)在線網(wǎng)站設(shè)計牙鲆TAK1的特異性引物(見表1)，以牙鲆各組織混合cDNA為模板,進(jìn)行PCR克隆驗證。

表1 實驗所用引物

1.4 PoTAK1基因序列分析

使用DNAMAN軟件導(dǎo)出PoTAK1基因的核苷酸序列與氨基酸序列對應(yīng)圖。使用SignalP 4.1工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)預(yù)測PoTAK1是否存在信號肽。使用SMART在線網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI中的CD-Search工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測PoTAK1基因的蛋白結(jié)構(gòu)域。使用Phyre2在線工具(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測PoTAK1的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，使用PyMol軟件顯示PoTAK1的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。使用ExPASy在線網(wǎng)站中的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)計算PoTAK1蛋白的分子量(Mw)和理論等電點(pI)。使用ClustalX 2.1程序?qū)⒀丽遗c其他物種TAK1的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析(見表2)，探究不同物種中TAK1氨基酸序列的一致性。使用Muscle方法將PoTAK1與其他物種TAK1基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(見表2)，然后通過MEGA7.0軟件并采用鄰接法(Neighbor-joining met-hod)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展值(Bootstrap)=1 000。

表2 實驗所用TAK1蛋白序列登錄號

1.5 牙鲆遲緩愛德華氏菌攻毒實驗

具體的牙鲆攻毒實驗步驟詳見本實驗室先前的報道[23]。

1.6 免疫刺激實驗

1.7 PoTAK1-EGFP-N1過表達(dá)載體構(gòu)建

在PoTAK1的ORF兩端設(shè)計分別帶有EcoR Ⅰ 和SacⅡ 酶切位點的引物(見表1)。通過雙酶切獲得PoTAK1的ORF克隆片段，將其連接到pEGFP-N1質(zhì)粒中，得到PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染備用。

1.8 PoTAK1的過表達(dá)與亞細(xì)胞定位

將生長狀態(tài)良好的牙鲆鰓細(xì)胞系FG-9307接種于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時，按照說明書步驟，使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑將PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至牙鲆FG-9307鰓細(xì)胞中，同時設(shè)置轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載質(zhì)粒對照組。轉(zhuǎn)染6 h后更換一次新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% NEAAS)，轉(zhuǎn)染48 h后，每個孔中加入DAPI(10 μg/mL)避光孵育10 min，孵育完成后，每個孔使用無菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，隨后將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板迅速置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 雙螢光素酶報告實驗

設(shè)置空載質(zhì)粒對照組：pEGFP-N1(300 ng)+ pAP1-luc(100 ng)+ pRL-TK(10 ng)和實驗組：PoTAK1-EGFP-N1(300 ng)+ pAP1-luc(100 ng)+ pRL-TK(10 ng)。將生長狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時，嚴(yán)格遵循說明書步驟，使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑按照上述分組情況將對應(yīng)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換一次新鮮的DMEM培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% NEAAS)，轉(zhuǎn)染48 h后按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega, USA)說明書的步驟進(jìn)行雙螢光素酶活性檢測。

1.10 免疫調(diào)節(jié)檢測實驗

除增設(shè)空白對照組(不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)外，其余轉(zhuǎn)染步驟與1.8中步驟相同。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入TNF-α(20 ng/mL)進(jìn)行免疫刺激。在24 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞樣品，提取RNA，通過qRT-PCR檢測AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化情況。

1.11 牙鲆各組織、細(xì)胞RNA的提取及cDNA的合成

具體的RNA提取及cDNA合成實驗步驟詳見本實驗室先前的報道[24]。

1.12 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用SYBR qPCR SuperMix定量試劑盒在Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀(Roche, Basel, Switzerland)上進(jìn)行qRT-PCR檢測。選擇牙鲆β-actin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s(40個循環(huán))，60 ℃ 40 s，每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值并使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，2-ΔΔCt法中相對值的設(shè)定和具體的算法可參照Livak K J等的報道[25]。本文中基因的表達(dá)變化倍數(shù)(Fold change)的計算方法為將實驗組和對照組在相應(yīng)時間點的目的基因的相對表達(dá)量求比值得到基因的表達(dá)變化倍數(shù)。

1.13 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以三個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0(IBM，NY，USA)進(jìn)行單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PoTAK1基因的序列分析

以牙鲆各組織混合cDNA為模板，PCR擴增獲得PoTAK1基因的ORF序列，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫中的牙鲆TAK1序列進(jìn)行比對，結(jié)果完全一致。PoTAK1的最長開放閱讀框(ORF)長為1 728 bp，編碼575個氨基酸，ExPASy中的ProtParam工具預(yù)測其蛋白分子量(Mw)約為64.33 kDa，理論等電點(pI)為6.66。SignalP 4.1工具在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白不存在信號肽。SMART在線網(wǎng)站和NCBI中的CD-Search工具預(yù)測PoTAK1蛋白在第27～275 aa位點存在一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域(Serine/threonine protein kinase catalytic domain, S_TKc domain)，在第499～562 aa位點存在一個卷曲螺旋區(qū)域(Coiled coil region)(見圖1)。同樣，在PoTAK1蛋白中也鑒定出與哺乳動物TAK1蛋白S_TKc結(jié)構(gòu)域中一致的兩個保守的蘇氨酸殘基(Thr)和一個典型的絲氨酸殘基(Ser)，分別位于PoTAK1蛋白序列中的Thr175、Thr178和Ser183氨基酸位點(見圖1)。此外，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果也顯示,在PoTAK1的N端存在一個S_TKc結(jié)構(gòu)域，在C端存在一個卷曲螺旋區(qū)域(見圖2)。

(灰色陰影部分表示S_TKc結(jié)構(gòu)域(27～275 aa位點)。綠色陰影部分表示卷曲螺旋區(qū)域(499～562 aa位點)。紅色字體表示保守的絲氨酸(Ser183)和蘇氨酸殘基(Thr175、Thr178)。星號表示終止密碼子。The S_TKc domain(27～275 aa)is shown in gray shadow.The coiled coil region(499～562 aa)is shown in green shadow.The conserved serine(Ser183)and threonine(Thr175, Thr178)residues are indicated by red font.The asterisk represents the stop codon.)

(藍(lán)色部分表示S_TKc結(jié)構(gòu)域。橙色部分表示卷曲螺旋區(qū)域。綠色部分表示PoTAK1蛋白質(zhì)的其余部位。The blue part represents the S_TKc domain.The orange part represents the coiled-coil region.The green part represents the rest of the PoTAK1 protein.)

2.2 氨基酸多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

牙鲆(P.olivaceus)的TAK1與半滑舌鰨(C.semilaevis)、斑馬魚(D.rerio)、斑點雀鱔(Lepisosteusoculatus)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、原雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的TAK1的氨基酸多序列比對結(jié)果顯示，TAK1蛋白序列在各物種中具有較高的保守性。在TAK1的N端均存在一個保守的S_TKc結(jié)構(gòu)域，在C端均存在一個保守的卷曲螺旋區(qū)域。此外，在S_TKc結(jié)構(gòu)域中均存在兩個保守的Thr殘基和一個典型的Ser殘基(見圖3)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示系統(tǒng)進(jìn)化樹分為明顯的3枝，其中牙鲆TAK1與其他硬骨魚聚為一枝，四足類動物TAK1(人、小鼠、原雞和熱帶爪蟾)聚為一枝，而牙鲆MAP3K2作為外類群單獨為一枝，且牙鲆TAK1與半滑舌鰨TAK1在親緣關(guān)系上最接近(見圖4)。

(不同顏色陰影區(qū)表示各序列中該位置處氨基酸的保守程度。紅色星號表示保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基。藍(lán)色條表示S_TKc結(jié)構(gòu)域，橙色條表示卷曲螺旋區(qū)域。The shaded regions with different colors indicate the degree of conservation of amino acids at this position in each sequence.Red asterisks indicate conserved serine and threonine residues.Blue bars indicate the S_TKc domain and orange bars indicate the coiled coil region.)

圖4 脊椎動物TAK1的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 PoTAK1基因的組織表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測PoTAK1基因在健康牙鲆各組織中的表達(dá)情況，如圖5所示，PoTAK1基因在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平具有一定的差異性。其中PoTAK1基因在肝臟、腦、鰓和肌肉中的表達(dá)量較高，心臟次之，在脾臟、腎臟和腸中的表達(dá)量較低。

(所有數(shù)據(jù)以三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。相同字母代表差異不顯著(p > 0.05)，不同字母代表差異顯著(p < 0.05)。All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.The same letter represents not significant difference(p > 0.05), and different letters represent significant difference(p < 0.05).)

2.4 遲緩愛德華氏菌感染牙鲆后PoTAK1基因的表達(dá)分析

本研究使用遲緩愛德華氏菌感染牙鲆成體魚后，對6個不同時間點(0、3、8、12、24和48 h)的注菌組和對照組的3個組織(脾臟、頭腎和鰓)進(jìn)行了取樣，通過qRT-PCR檢測遲緩愛德華氏菌感染后牙鲆各組織中PoTAK1基因的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示遲緩愛德華氏菌感染能引起PoTAK1基因表達(dá)量不同程度的變化。如圖6(A)所示，在脾臟中，PoTAK1的表達(dá)量呈先升高后降低趨勢，在感染后12 h達(dá)到峰值，是對照組表達(dá)量的1.67倍；如圖6(B)所示，在頭腎中，PoTAK1的表達(dá)量呈升高-降低-升高的趨勢，在感染后3和48 h出現(xiàn)2個峰值，分別是對照組表達(dá)量的1.37和1.43倍；如圖6(C)所示，在鰓中，注菌組和對照組之間PoTAK1的表達(dá)量無顯著變化。

((A)脾臟；(B)頭腎；(C)鰓。所有數(shù)據(jù)以三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。和代表差異顯著(:p < 0.05，:p < 0.01)。(A)Spleen;(B)Head kidney;(C)Gill.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates. and represent significant difference(:p < 0.05, :p < 0.01).)

2.5 免疫刺激牙鲆鰓細(xì)胞系后PoTAK1基因的表達(dá)分析

((A)PBS；(B)Poly I C；(C)TNF-α；(D)遲緩愛德華氏菌。所有數(shù)據(jù)以三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。和代表差異顯著(:p < 0.05，:p < 0.01)。(A)PBS;(B)Poly I C;(C)TNF-α;(D)E. tarda.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates. and represent significant difference(:p < 0.05, :p < 0.01).)

2.6 PoTAK1蛋白的亞細(xì)胞定位

使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1空載質(zhì)粒和PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒后牙鲆鰓細(xì)胞的熒光情況，結(jié)果顯示與其他脊椎動物蛋白類似，PoTAK1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(見圖8)。

2.7 過表達(dá)PoTAK1對MAPK通路下游AP-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

為確定PoTAK1對MAPK通路下游AP-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，我們在HEK-293T細(xì)胞系中進(jìn)行了雙螢光素酶報告實驗。結(jié)果顯示，與pEGFP-N1空載質(zhì)粒對照組相比，PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒組中AP-1的螢光素酶活性顯著升高(見圖9)，表明PoTAK1的過表達(dá)能夠激活MAPK通路下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性。

(所有數(shù)據(jù)以三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。代表差異顯著(p < 0.01)。All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.represent significant difference(p < 0.01).)

2.8 過表達(dá)PoTAK1對AP-1通路下游 IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

本研究使用牙鲆FG-9307鰓細(xì)胞系轉(zhuǎn)染PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒對PoTAK1進(jìn)行過表達(dá)，如圖10(A)所示，PoTAK1-EGFP-N1重組質(zhì)粒組中PoTAK1的表達(dá)量顯著高于空白對照組和pEGFP-N1空載質(zhì)粒對照組，表明PoTAK1過表達(dá)成功。隨后，我們使用TNF-α(20 ng/mL)作為免疫原，對PoTAK1過表達(dá)成功的牙鲆FG-9307鰓細(xì)胞系刺激24 h后，對各對照組和實驗組的細(xì)胞進(jìn)行取樣，并通過qRT-PCR檢測AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，PoTAK1的過表達(dá)使得AP-1通路下游各促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量均有不同程度的升高，其中與空白對照組和pEGFP-N1空載質(zhì)粒對照組相比，IL-1β的表達(dá)量均升高約1.50倍(見圖10(B))；IL-6的表達(dá)量分別升高61.50和123.40倍(見圖10(C))；IL-8的表達(dá)量分別升高1 532.70和55.40倍(見圖10(D))；TNF-α的表達(dá)量分別升高7.65和5.73倍(見圖10(E))。

((A)：在牙鲆鰓細(xì)胞中過表達(dá)PoTAK1后，TAK1基因的表達(dá)量變化；(B)、(C)、(D)、(E)：轉(zhuǎn)染48 h后，牙鲆鰓細(xì)胞用TNF-α(20 ng/mL)刺激24 h，通過qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)變化。所有數(shù)據(jù)以三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。相同字母表示差異不顯著(p > 0.05)，不同字母表示差異顯著(p < 0.05)。(A)：Changes of expression levels of the TAK1 gene in Japanese flounder gill cells after PoTAK1 overexpression.(B)、(C)、(D)、(E)：After transfection 48 h, the gill cells of Japanese flounder were stimulated with TNF-α(20 ng/mL)for 24 h, and the expression changes of IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α were detected by qRT-PCR.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.The same letter represents not significant difference(p > 0.05), and different letters represent significant difference(p < 0.05).)

3 討論

轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1，又稱MAP3K7)屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族成員，在哺乳動物中已被證明是炎癥和免疫信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3]。有研究表明,從蒼蠅(Muscadomestica)到哺乳動物，TAK1基因在先天免疫中發(fā)揮的功能是保守的[2,8]。在哺乳動物組織中(如小鼠的小腸、結(jié)腸上皮組織、皮膚表皮組織和腎臟組織等)，TAK1基因?qū)τ诙喾N炎癥配體的反應(yīng)至關(guān)重要[8, 26-28]；而在果蠅(Drosophila)的先天免疫反應(yīng)中，TAK1基因?qū)τ谀承┛咕牡谋磉_(dá)是必需的[8,29]。在過去的幾十年里，大量有關(guān)TAK1基因的研究報道主要集中于哺乳動物,如對小鼠的研究表明，TAK1基因是介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AP-1激活的關(guān)鍵核心分子，并在發(fā)育、細(xì)胞存活和免疫反應(yīng)等生物過程中發(fā)揮著重要作用[30-33]。然而，對于硬骨魚，尤其是牙鲆TAK1基因的結(jié)構(gòu)和功能方面的研究還十分有限。因此，本研究以我國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種——牙鲆為研究對象，對PoTAK1基因的序列特征、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、表達(dá)模式和免疫功能等進(jìn)行了探究。

在哺乳動物中的研究表明，TAK1蛋白N端的S_TKc結(jié)構(gòu)域能與TAB1結(jié)合激活TAK1的激酶活性，并進(jìn)一步磷酸化IKKs和MAPKs[34-35]，而C端的卷曲螺旋區(qū)域能與TAB2結(jié)合，從而介導(dǎo)TAK1與TRAF6之間的相互作用[36]。在本研究中，通過蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白同樣在其N端具有一個保守的S_TKc結(jié)構(gòu)域，在其C端具有一個保守的卷曲螺旋區(qū)域，提示PoTAK1蛋白可能也具有與哺乳動物TAK1類似的功能。多序列比對結(jié)果顯示，PoTAK1氨基酸序列與其他物種的一致性非常高，均在80%以上。且PoTAK1蛋白同樣具有相當(dāng)保守的氨基酸殘基(Thr175、Thr178和Ser183)，這些氨基酸殘基在哺乳動物TAK1中已被證明是TAB1誘導(dǎo)的TAK1自激活過程中重要的自磷酸化位點[34]，提示PoTAK1可能也保留了類似的磷酸化自激活功能。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，PoTAK1與其他物種TAK1具有良好的聚類關(guān)系, PoTAK1先與半滑舌鰨TAK1聚為一小枝，再與其他硬骨魚類TAK1聚為一大枝,其原因可能是牙鲆和半滑舌鰨同屬于鲆鰈魚類，親緣關(guān)系較近。我們推測TAK1基因在進(jìn)化上高度保守，其在各物種之間具有相似的結(jié)構(gòu)與功能。

對人(H.sapiens)[37]、中華蜜蜂(Apisceranacerana)[38]、草魚(C.idella)[10]等物種的研究表明，TAK1廣泛表達(dá)于各組織中。類似的，在本研究中，通過qRT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1在牙鲆各組織中均有廣泛表達(dá)，但表達(dá)水平有一定的差異性，PoTAK1在肝臟和鰓中的表達(dá)量較高，這與虹鱒(O.mykiss)[12]、梭魚(Lizahaematocheila)[39]中TAK1的組織表達(dá)情況(肝臟中的表達(dá)量較高)以及斜帶石斑魚(E.coioides)[11]中TAK1的組織表達(dá)情況(鰓中的表達(dá)量較高)類似，但與大黃魚(Larimichthyscrocea)中TAK1的組織表達(dá)情況差別較大(腎臟和脾臟中的表達(dá)量較高)[40]，這種組織表達(dá)差異可能是魚種類不同所導(dǎo)致的。考慮到肝臟和鰓是硬骨魚類重要的免疫器官[41]，PoTAK1在牙鲆肝臟和鰓中的高表達(dá)提示其可能在牙鲆的先天免疫中發(fā)揮一定的作用。Qi Z T等通過qRT-PCR檢測了腹腔注射停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)后梭魚(L.haematocheila)體內(nèi)脾臟、頭腎、鰓、腸等多個免疫器官中TAK1的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)停乳鏈球菌刺激后，梭魚TAK1在各免疫器官中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，這表明TAK1可能參與了梭魚抵御細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)[39]。類似的，為了探究PoTAK1潛在的免疫功能，本研究選取了牙鲆養(yǎng)殖過程中最常見的病原菌之一——遲緩愛德華氏菌為感染源[17-18]，通過腹腔注射遲緩愛德華氏菌和qRT-PCR實驗，檢測了遲緩愛德華氏菌感染后牙鲆三種重要免疫器官脾臟、頭腎和鰓中TAK1的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，脾臟和頭腎中PoTAK1的表達(dá)量在遲緩愛德華氏菌感染后均顯著上調(diào)，這表明PoTAK1可能參與了牙鲆抵御遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應(yīng)。從整體上看，經(jīng)遲緩愛德華氏菌刺激后，在脾臟中，PoTAK1的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，而在頭腎中，PoTAK1的表達(dá)量呈升高-降低-升高的趨勢，PoTAK1表達(dá)模式的不同可能與各組織在免疫反應(yīng)中行使的功能不同有關(guān)。在鰓中PoTAK1的表達(dá)量在感染前后無顯著變化，我們推測鰓中的PoTAK1可能在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌感染過程中不發(fā)揮主要作用。

亞細(xì)胞定位有助于我們理解該基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中存在的具體位置及其可能發(fā)揮的功能[43]。Li Y W等通過GFP綠色熒光融合蛋白法發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚(E.coioides)的TAK1蛋白主要在 HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[11]。類似的，在本研究中，通過在牙鲆FG-9307細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PoTAK1-EGFP-N1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白也主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，這表明TAK1蛋白可能在硬骨魚中具有相似的定位表達(dá)模式。考慮到TAK1是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號分子[4-5]，我們推測PoTAK1參與了細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

在哺乳動物中的研究表明，TAK1通過磷酸化激活MAPKs進(jìn)而激活A(yù)P-1[30]。AP-1是MAPK信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子，因此AP-1的激活情況在一定程度上反映了MAPK信號通路的激活情況[44]。在本研究中，蛋白序列分析結(jié)果顯示，PoTAK1保留了與哺乳動物TAK1蛋白中相對應(yīng)的保守磷酸化位點(牙鲆中為Thr169和Thr175；哺乳動物中為Thr178和Thr184)，這兩個氨基酸位點的磷酸化對于TAK1介導(dǎo)的AP-1的激活是必須的[33]。基于已有的文獻(xiàn)報道和結(jié)果，我們猜測PoTAK1也能夠激活A(yù)P-1。為了驗證這一猜想，我們在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行了雙螢光素酶報告實驗。結(jié)果顯示PoTAK1的過表達(dá)顯著激活了AP-1 螢光素酶報告質(zhì)粒的活性，這表明我們的猜想正確，PoTAK1保留了哺乳動物中TAK1激活A(yù)P-1轉(zhuǎn)錄因子的功能，并提示在牙鲆中可能也是通過TAK1激活MAPK信號通路進(jìn)而激活A(yù)P-1。

炎癥細(xì)胞因子是一類主要由免疫細(xì)胞分泌的小分子多肽物質(zhì)，可分為促炎和抗炎細(xì)胞因子兩類，主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)等。炎癥細(xì)胞因子通過與靶細(xì)胞上的受體相結(jié)合，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[45-46]。作為細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，AP-1可以調(diào)節(jié)脊椎動物中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。如Gao Y等發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的小鼠THP-1細(xì)胞中，LL202可以通過抑制AP-1的活性來抑制IL-1β、IL-6的mRNA及其蛋白的表達(dá)[47]；Ondrey F G等發(fā)現(xiàn)激活的 AP-1 能促進(jìn)人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中IL-8的表達(dá)[48]；Smolinska M J等發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的人原代巨噬細(xì)胞中，激活的AP-1參與了IL-6和TNF-α的表達(dá)[49]。類似的，在本研究中，為了進(jìn)一步研究PoTAK1在AP-1通路中的作用，基于雙螢光素酶報告實驗結(jié)果，我們通過在牙鲆鰓細(xì)胞系FG-9307中過表達(dá)PoTAK1的方式激活A(yù)P-1，以TNF-α為免疫刺激物，隨后檢測了AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化，qRT-PCR結(jié)果顯示PoTAK1的過表達(dá)能顯著上調(diào)IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)，IL-1β的表達(dá)變化雖不顯著，但與對照組相比也有1.5倍的上升，這提示PoTAK1可能通過上調(diào)IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來促進(jìn)牙鲆的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)。結(jié)合雙螢光素酶報告和免疫調(diào)節(jié)檢測實驗結(jié)果，我們推測在受到免疫刺激后，牙鲆通過PoTAK1激活MAPK信號通路從而激活A(yù)P-1，激活的AP-1通過調(diào)節(jié)其下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)牙鲆的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)語

本研究克隆了牙鲆PoTAK1基因，并對其序列進(jìn)行了驗證。氨基酸多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，TAK1基因在各物種間高度保守；組織表達(dá)分析顯示，PoTAK1基因具有潛在的免疫功能；體內(nèi)攻毒和體外免疫刺激實驗表明，PoTAK1可能在牙鲆抵御病原體侵染過程中發(fā)揮了重要作用；亞細(xì)胞定位顯示，PoTAK1為胞質(zhì)蛋白，可能參與了細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；雙螢光素酶報告和免疫調(diào)節(jié)檢測顯示，PoTAK1的過表達(dá)能夠激活MAPK通路下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性并上調(diào)AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PoTAK1在牙鲆先天免疫反應(yīng)所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。