cd36基因在斑馬魚抗鰻弧菌免疫調控中的作用?

李 夢，王 敏，鐘慎杰，邢澤宇，劉振輝

(中國海洋大學海洋生命學院，海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003)

清道夫受體(Scavenger receptors, SR)由一個結構多樣的跨細胞膜糖蛋白家族組成。根據蛋白的多個結構域，它們被分為8個類別(A～H)[1]。CD36(或稱為脂肪酸轉位酶，FAT)屬于B族清道夫受體，具有兩個跨膜結構域、一個胞外環和兩端較短的胞內尾巴[1-4]，是該家族中第一個被成功鑒定的。它在巨噬細胞、血小板、脂肪細胞、內皮細胞和上皮細胞中表達[1]。CD36能與多種配體結合，包括：天然的、氧化的和乙酰化的低密度脂蛋白[2,5]；帶負電的磷脂質[6]、長鏈脂肪酸、血栓反應蛋白-1[7]；纖維樣淀粉狀蛋白和凋亡細胞[8-9]。因此，它與多種生理過程有關，如血管生成、脂質代謝和飲食偏好等[5]。有大量的關于CD36介導了修飾的LDL內吞，其在泡沫細胞形成、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病中作用的研究[1,10-12]。

對哺乳動物CD36的研究發現，其在先天性免疫和宿主識別外源性病原體和調節炎癥細胞因子的產生中具有重要作用[13-17]。CD36已經被證實是識別脂磷壁酸(LTA)和某些甘油酸二酯的必要輔助受體，能激活TLR2/6(Toll like receptor2/6)[18]。在小鼠巨噬細胞中敲除Cd36基因，會減少細菌誘導的IL-6的分泌[19]。對于子宮內膜異位者，其腹腔巨噬細胞內Cd36表達量明顯降低，細胞吞噬功能也有明顯受損[20]。CD36受體可與Src家族中蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族的Fyn、Yes和Lyn 3個成員結合，而這3個成員已被證實是血小板中參與激活MAPK的上游GTPases[21-22]。也有報道，CD36以不依賴于TLR2/4的方式通過JNK途經介導抗細菌免疫信號[13]。此外，在以果蠅為模型的實驗中，CD36家族成員被證明是機體吞噬微生物和高效清除細菌所必需的[23-24]。

魚類的生理反應與哺乳動物有明顯的不同，類似地，魚類免疫反應的分子機制可能也與哺乳動物不同[25-27]。事實上，CD36在魚類免疫反應中的確切功能仍是一個需要進一步探究的課題。例如，cd36基因并不在成年鯉魚的免疫器官和細胞中表達[28]；但在斑馬魚體內cd36被證實能夠與細菌結合[28]，并且敲除cd36基因的斑馬魚幼魚會更易被細菌感染[29]。通過本實驗，發現注入鰻弧菌后，突變體斑馬魚(cd36-/-)的活躍度和存活率明顯低于野生型斑馬魚(WT)。在cd36-/-斑馬魚中，與抗原呈遞相關的基因mhc1和cd8、穿孔素基因perforin、補體系統關鍵基因c3和細胞因子基因il4的表達均明顯下調。本研究為CD36在魚類抗菌免疫中的功能提供了新證據。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚和鰻弧菌

實驗所用動物均遵循中國海洋大學動物保護與使用委員會制定的倫理準則(許可證號碼, SD2007695)。本研究前期利用TALENs技術從斑馬魚AB系中建立了斑馬魚cd36敲除突變株(cd36-/-)[30]。斑馬魚在標準魚類養殖設施中飼養和繁殖，并保持L∶D=14 h∶10 h黑暗的光周期。

實驗所用鰻弧菌為中國海洋大學張曉華教授所贈。菌株在2216E培養液中28 ℃擴大培養24 h，4 ℃、8 000g離心20 min收獲，用0.01 mol/L生理鹽水(PBS，pH=7.2)重懸，終濃度1×108CFU/mL。

1.2 鰻弧菌刺激

隨機抽取突變體(cd36-/-)和野生型(WT)成年斑馬魚每組各10尾(0.40±0.05)g，腹腔注射活鰻弧菌20 μL(1×108CFU/mL)。注射24 h后監測疾病癥狀、活動能力和死亡率。該實驗獨立重復進行3次。

1.3 轉錄組測序

斑馬魚在組織采集前24 h開始禁食。每組隨機選取3條突變體(cd36-/-)和3條野生型(WT)成年斑馬魚(0.40±0.05)g，每條魚腹腔注射活鰻弧菌20 μL(1×108CFU/mL)。注射后4 h，將每組3條魚的頭腎組織混合并提取RNA，每組準備3個獨立的樣本用于轉錄組測序。

用RNAiso plus(TaKaRa)試劑盒按說明書指導提取總RNA，用Agilent 2100 RNA Nano 6000試劑盒(Agilent Technologies, CA, USA)檢測RNA提取質量。使用結合寡核苷酸(dT)的磁珠富集mRNA，反轉錄cDNA片段，通過添加單個‘A’堿基進行末端修復。連接產物經瓊脂糖凝膠電泳篩選，PCR擴增后送AnnoroadTechnology公司(Beijing, China)通過Illumina HiSeq 4000A平臺測序。

測序結果結合local BLAST programsagainst NCBI non-redundant(nr)protein、Swiss-Prot/TrEMBL、Clusters of Orthologous Groups(COG/KOG)、Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)等數據庫對差異表達基因進行功能注釋。

1.4 差異表達基因(DEGs)鑒定

采用RPKM(Reads per kb per million reads)方法計算和標準化基因豐度[31]，跨組別的差異表達基因通過edgeR軟件包鑒別(http://www.r-project.org/)。基因表達變化量≥2倍且錯誤率(FDR)>0.05時，認為是顯著表達。利用GO數據庫,通過計算差異表達基因參與生物學過程、細胞組分、分子功能的超幾何分布，進行功能分類注釋和富集分析[32]，最后，用KEGG數據庫獲得代謝通路注釋信息[33]。以上分析均以P<0.05作為統計學顯著性的閾值。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

如前所述，用RNAiso plus試劑盒(TaKaRa)從斑馬魚腸組織中提取總RNA[34]。經DNA酶消化處理后，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser試劑(TaKaRa)根據廠家提供的說明，合成cDNA鏈，同時加入不含逆轉錄酶的樣品作為對照。合成的cDNA產物在-20 ℃保存待用。

用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測mhc1、cd8、perforin、c3和il4的表達，根據基因序列，利用Primer Premier 5.0程序設計各基因特異性引物(見表1)。選擇肌動蛋白(actin)基因作為內標參考。cDNA模板定量后，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Takara)在ABI 7500 real-time PCR系統(Applied Biosystems)上進行實時PCR反應，具體步驟如前所述[35]。采用對比CT值法計算mhc1、cd8、perforin、c3和il4相對于actin基因的表達水平(2-ΔΔCT)[36]。所有qRT-PCR實驗均樣本均設置3個平行樣，并獨立重復3次。

表1 文中用到的引物序列

1.6 統計分析

通過GraphPad Prism 5軟件對所得數據采用配對樣本T檢驗進行統計分析，差異性P<0.05被認為是有顯著差異的。所有數據均以標準差(mean±S.D.)表示。

2 結果

2.1 cd36-/-斑馬魚更易感染鰻弧菌

分別對突變型(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚腹腔注射20 μL濃度為1×108CFU/mL的鰻弧菌溶液。感染鰻弧菌后6 h內未發現斑馬魚死亡，但突變體斑馬魚的移動性明顯低于野生斑馬魚，且病害癥狀更加嚴重，主要表現為體表較明顯的紅腫充血(見圖1(A))。注射后7 h，突變體開始死亡，而野生斑馬魚在注射后8.5 h開始死亡。因此注射后8.5 h，突變體斑馬魚的存活率明顯低于野生斑馬魚(見圖1(B))。

圖1 突變體(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚在被鰻弧菌攻擊后的發病癥狀(A)及存活率(B)比較(n=10)

2.2 鰻弧菌刺激cd36-/-和野生斑馬魚后，對差異表達基因的轉錄組分析

為了探討cd36在免疫過程中的分子機制，本文作者取腹腔注射了濃度為1×108CFU/mL鰻弧菌菌液的野生型和cd36-/-斑馬魚的頭腎組織，進行了轉錄組測序分析。FPKM(Fragments per kilobase per millon mapped fragments)即每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數目被用來評估cd36-/-與野生斑馬魚的基因表達量是否滿足分析要求。通過分析發現，與野生型斑馬魚相比，突變體中有1 517個基因表達上調，3 801個基因表達下調(見圖2(A))。為了更好地了解差異表達基因在免疫過程中的作用，本文作者對這些基因進行了GO和KEGG富集分析。

GO注釋數據庫可以對突變型和野生型樣本的差異表達基因進行統計分析，按照功能被分為三方面，分別為生物學過程、細胞組分和分子功能。與野生型斑馬魚相比，突變體中的差異表達基因主要與細胞過程、生物調節、代謝過程和應激反應相關(見圖2(B))。圖3(A)顯示了通過GO富集分析后，被挑選出的與免疫過程相關的差異表達基因。這些基因在防御反應中起著關鍵作用，值得注意的是，在28個差異表達基因中有7個基因被歸類到T淋巴細胞的免疫過程中(見圖3(A)、表2)。這表明cd36可能參與了調節T細胞免疫。

表2 通過GO富集分析挑選出的與免疫系統相關的差異表達基因(cd36-/- vs WT)

((A)差異表達基因的數量。(B)GO注釋數據庫對樣本的差異表達基因按照生物學過程的功能進行統計分析。紅色表示差異表達上調基因占總差異表達上調基因的比例；綠色表示差異表達下調基因占差異表達總下調基因的比例。(1)生殖；(2)細胞殺傷；(3)免疫系統過程；(4)行為；(5)代謝過程；(6)細胞增殖；(7)細胞過程；(8)氮利用；(9)生殖過程；(10)生物黏附；(11)信號；(12)多細胞生物過程；(13)發育過程；(14)生長；(15)運動；(16)色素沉積；(17)節律過程；(18)刺激反應；(19)定位；(20)多有機體過程；(21)生物調節；(22)細胞組成的組織或生物發生；(23)細胞聚集；(24)解毒作用；(25)參與化學突觸傳遞的突觸前過程。(A)The count of the differential expressed genes.(B)GO analysis of differentially expressed genes.The DEGs were enriched in GO biological process.Red stands for the proportion of differentially expressed up-regulated genes to the total differentially expressed up-regulated genes; Green stands for the proportion of differentially expressed down-regulated genes to the total differentially expressed down-regulated genes.(1)Reproduction;(2)Cell killing;(3)Immune system process;(4)Behavior;(5)Metabolic process;(6)Cell proliferation;(7)Cellular process;(8)Nitrogen utilization;(9)Reproductive process;(10)Biological adhesion;(11)Signaling;(12)Multicellular organismal process;(13)Developmental process;(14)Growth;(15)Locomotion;(16)Pigmentation;(17)Rhythmic process;(18)Response to stimulus;(19)Localization;(20)Multi-organism process;(21)Biological regulation;(22)Cellular component organization or biogenesis;(23)Cell aggregation;(24)Detoxification;(25)Presynaptic process involved in chemical synaptic transmission.)

((A)28個差異表達中有7個基因被歸類到T淋巴細胞的免疫過程中(圖中下劃線示出)。(B)—(F)在鰻弧菌的攻擊下，突變體(cd36-/-)和野生型(WT)斑馬魚頭腎組織中mhc1uba(B)、cd8(C)、perforin(D)、c3(E)和il4(F)基因表達量的比較。(A)7/28 of the DEG genes were assigned to the immune process of T lymphocyte(Underlined part in this figure).(B)—(F)Comparison of the expression of mhc1uba(B), cd8(C), perfoin(D), c3(E)and il4(F)in intestinal tissues between the mutant type(cd36-/-)and wild type(WT)zebrafish challenged by Vibrio anguillarum.)

通過KEGG分析找出差異性顯著的基因富集的信號通路，與野生斑馬魚相比，突變體斑馬魚中差異表達較明顯的基因主要富集在補體系統、系統性紅斑狼瘡、細胞因子之間的相互作用和病毒致癌機理等與免疫相關的信號途徑中(見圖4)，反映了cd36在免疫應答中起到調節作用。

圖4 差異表達基因的12條信號通路KEGG分析

2.3 cd36-/-斑馬魚的mhc1uba、cd8、穿孔素、c3和il4基因表達下調

本研究通過實時熒光定量PCR技術進一步證實，cd36基因敲除對斑馬魚免疫相關基因的表達產生影響。與野生型(WT)斑馬魚相比，突變型(cd36-/-)斑馬魚的抗原提呈相關基因mhc1uba和cd8、穿孔素基因、補體系統關鍵基因c3和細胞因子基因il4的表達水平顯著下調(見圖3(B)—(F))。

3 討論

目前對cd36免疫功能的研究主要以哺乳動物為研究對象，探究了cd36在識別、遞呈、吞噬和清除細菌方面的功能。例如，過表達cd36的HEK293T細胞與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的結合能力分別提高了3和2倍[16]；在小鼠巨噬細胞中過表達cd36也增強了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的攝取，產生了更高水平的tnf-α和mip-2，增強了下游免疫因子的級聯反應和巨噬細胞的吞噬作用,因而認為CD36是細菌的吞噬受體[13,24]；另外，cd36基因敲除小鼠在攝取凋亡巨噬細胞方面存在明顯缺陷[37]。而關于cd36抗細菌免疫的功能在魚類中的報道較少。2015年，Fink等發現cd36基因并不在鯉魚的免疫器官和免疫細胞中表達，似乎顯示其與免疫功能關系不大[27]；但同時他們又發現cd36卻在斑馬魚的免疫細胞中表達，且敲降cd36的斑馬魚清除細菌的能力下降[27]。后者與本研究在斑馬魚中的研究結果一致。

本文作者前期的研究發現，cd36基因在斑馬魚的免疫組織中有表達，且CD36可與細菌結合[29]，表明斑馬魚CD36可能參與抗細菌免疫。在本研究中，用鰻弧菌攻擊斑馬魚發現，與野生型斑馬魚相比，cd36基因敲除斑馬魚發病速度更快，細菌感染病癥更明顯，存活率更低，進一步證明CD36參與了斑馬魚的抗細菌免疫，發揮正向調控作用。這與CD36在哺乳動物中的識別細菌和調節炎癥細胞因子的產生功能相一致，揭示了CD36在抗細菌免疫反應中的保守性。轉錄組測序結果顯示，在鰻弧菌感染的條件下，敲除cd36基因引起了斑馬魚大量基因表達的上調或下調。這些差異表達的基因主要富集在補體系統、系統性紅斑狼瘡、細胞因子之間的相互作用和病毒致癌機理等信號途徑中。腹腔注射鰻弧菌后，通過實時熒光定量技術檢測，cd36基因敲除斑馬魚中mhc1uba、cd8、il4、c3和穿孔素(perfoin)的基因表達量明顯低于野生型斑馬魚。在免疫過程中，MHC1和CD8在向殺傷性T細胞呈遞抗原中發揮重要作用；白細胞介素IL4能刺激活化B細胞和T細胞的增殖，增強B細胞的抗原提呈能力；C3是先天免疫補體系統的關鍵因子；穿孔素主要儲存在細胞毒性T細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)的胞漿顆粒中，是殺傷靶細胞的主要效應分子。據此可以推測，CD36可能通過調控斑馬魚的先天性免疫系統和適應性免疫系統,尤其可能通過調節T細胞免疫而發揮抗細菌免疫作用。本研究為進一步研究CD36在免疫防御中的作用及分子機制奠定了基礎。