維生素D3對帕金森病小鼠的保護作用及機制研究

王孺賢 馮彩霞 劉雪齊 烏 蘭

1.內蒙古科技大學包頭醫學院研究生院，內蒙古包頭 014040；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院神經內科，內蒙古包頭 014030

帕金森病（parkinson disease，PD）的病理特征是選擇性黑質多巴胺能神經元變性壞死，-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）的異常聚集被認為是PD致病的關鍵因素。α-syn包含體異常聚集引起黑質紋狀體通路遭受破壞，殼核、尾狀核中多巴胺的含量降低，從而誘發一系列錐體外系癥狀[1-2]。維生素D3（vitamin D3，VD3）也稱膽鈣化醇，依次經肝臟25-羥化酶、腎臟1 -羥化酶作用，最后生成1，25-二羥維生素D3[3-4]。維生素D屬于類固醇激素的一種，能與維生素D受體結合調節乙酰膽堿、多巴胺等神經遞質的合成[5-6]。針對中晚期PD患者的異動癥、癥狀波動及復方左旋多巴的療效減退，一直沒有有效的控制藥物，希望本研究能為臨床提供一定的思路。本研究旨在通過研究PD小鼠黑質α-syn、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的變化，探討VD3對帕金森病模型小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只C57BL/6J雄性8～10周的小鼠，體質量22～25 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，使用許可證：SCXK（京）2019-0010。在溫度20℃～24℃、濕度40%～70%的條件下普通飼料飼養，12 h晝夜節律。動物的治療和行為測試在光周期進行。小鼠適應環境5 d后開始實驗。實驗過程遵循包頭醫學院第二附屬醫院實驗動物倫理委員會相關規定（2020年科倫審第LW-009）。

1.2 主要試劑與儀器

VD3（索萊寶科技有限公司，批號：V8070， 規格：1000 mg，含量97%）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）（美國Sigma，批號：M0896，規格：100 mg）；抗體（英國abcam公司）；RNA提取試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；引物制備（生工生物技術股份有限公司）。

1.3 PD小鼠模型[7]建立及分組

50只小鼠隨機分為5組，模型組給予MPTP（20 mg/kg）腹腔注射，30 min后注射與VD3等體積的生理鹽水7 d，后每天腹腔注射等體積的生理鹽水14 d；低、中和高不同劑量VD3組給予MPTP（20 mg/kg）腹腔注射，30 min后分別腹腔注射VD3（0.5、1.0、2.0 μg/kg）7 d，后每天腹腔注射VD314 d；對照組腹腔注射與MPTP組等體積的生理鹽水，30 min后注射與VD3等體積的生理鹽水7 d，然后每天腹腔注射等體積的生理鹽水14 d。

1.4 第21天對小鼠進行神經行為學測試

1.4.1 爬桿試驗評價小鼠運動協調能力 采用直徑為1 cm，長度50 cm的木桿，直徑為2.5 cm的一個小球固定在木桿的頂部，木桿用紗布纏繞，將小鼠放于球頂，小鼠的兩只前上肢接觸桿底所在平臺時定義為爬完全程[8]，記錄小鼠在木桿頂部的停留時間和爬桿時間，測定3次，間隔時間1 h，取平均值。

1.4.2 滾軸實驗評價小鼠運動平衡能力 將預訓練的小鼠置于轉桿上，轉棒儀轉速4～40 r/min，記錄小鼠從轉棒開始旋轉到掉下轉棒的時間，測試時間5 min，測定3次，間隔時間1 h，取平均值。

1.5 RNA提取和實時熒光定量PCR（qPCR）

小鼠黑質總RNA濃度測定采用Trizol試劑和異丙醇沉淀法分離。應用反轉錄試劑盒按總RNA 1 μg為模板將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。以GAPDH為內參引物，結果采用2-ΔΔCT法計算α-syn、TH的mRNA的相對表達水平。引物見表1。

表1 引物序列

1.6 Western Blot檢測黑質α-syn、TH的相對表達水平

冰上取小鼠中腦黑質，蛋白提取按照RIPA細胞組織裂解液說明書進行，蛋白定量按BCA方法進行，取40 μg總蛋白首先進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后依次轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后曝光顯色，最后利用Image J軟件計算PVDF條帶上的灰度值，α-syn、TH蛋白的灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值為α-syn 、TH蛋白的相對表達量。分析腦組織α-syn、TH相對表達水平。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 VD3對PD小鼠神經行為學的影響

第21天，與對照組比較，模型組停留時間、爬桿時間延長，轉桿時間縮短，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，中、高劑量組小鼠的停留時間、爬桿時間縮短，轉桿時間延長，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 VD3對PD病小鼠行為學的影響（s，±s，n=8）

表2 VD3對PD病小鼠行為學的影響（s，±s，n=8）

注 與對照組相比，aP＜ 0.05，aaP＜ 0.01，aaaP＜ 0.001；與模型組相比，bP＜ 0.05，bbP＜ 0.01；與低劑量組相比，cP＜ 0.05

指標 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 F值 P值停留時間 2.50±0.92 4.88±1.24aaa 4.00±1.30a 3.00±1.30bb 2.75±1.28bbc 5.246 0.002爬竿時間 12.75±2.12 23.13±3.18aaa 19.50±4.24aa 18.00±3.33aab 16.75±5.41abb 7.882 0.000轉桿時間 265.12±42.03 114.12±33.66aaa 138.75±42.84aaa 169.25±35.97aaabb 180.75±39.79aaabbc 17.337 0.000

2.2 VD3對PD小鼠黑質α-syn、TH蛋白及mRNA相對表達水平的影響

與對照組相比，模型組小鼠α-syn的mRNA及蛋白表達水平顯著升高、TH的mRNA及蛋白表達水平顯著下降；與模型組比較，中、高劑量組小鼠的α-syn的mRNA及蛋白表達水平下降、TH的mRNA及蛋白表達水平上升，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。與低劑量組比，中、高劑量組小鼠的α-syn的mRNA及蛋白表達水平下降、TH的mRNA及蛋白表達水平上升，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖1、表3。

表3 VD3對PD小鼠α-syn、TH蛋白及mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

表3 VD3對PD小鼠α-syn、TH蛋白及mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

注 與對照組相比，aP＜ 0.05，aaP＜ 0.01，aaaP＜ 0.001；與模型組相比，bP＜ 0.05，bbP＜ 0.01，bbbP＜ 0.001；與低劑量組相比，cP＜ 0.05，ccP＜ 0.01；α-syn ：α-突觸核蛋白；TH：酪氨酸羥化酶

指標 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 F值 P值α-syn 0.38±0.17 1.22±0.25aaa 1.08±0.21aaa 0.75±0.14aaabbbcc 0.81±0.14aaabbbcc 23.913 0.000 TH 1.05±0.13 0.52±0.15aaa 0.57±0.16aaa 0.72±0.15aaabbc 0.76±0.12aaabbc 17.071 0.000 α-syn mRNA 0.37±0.10 1.36±0.22aaa 1.02±0.26aaabb 0.76±0.18aaabbbc 0.74±0.17aaabbbcc 27.617 0.000 TH mRNA 1.01±0.07 0.55±0.20aaa 0.49±0.18aaa 0.74±0.20aabcc 0.79±0.16abbcc 12.562 0.000

圖1 α-syn、TH蛋白印跡條帶圖

3 討論

VD是一種神經營養素，是一種神經遞質的誘導劑，與VD受體作用發揮抗炎作用[1，9]。酪氨酸羥化酶是合成多巴胺的關鍵酶，VD能刺激酪氨酸羥化酶的表達，VD通過調節多巴胺的合成發揮作用[10-11]。據研究，補充VD的嚙齒動物，黑質的神經元存活率提高，氧化損傷降低，多巴胺水平升高[12-15]，白介素-6和脂質過氧化物表達減少[14]。本研究PD小鼠模型為亞急性小鼠模型，采用MPTP腹腔注射7 d制備[7]，與正常對照組比較，模型組小鼠停留時間、爬桿時間延長，轉桿時間縮短，模型組小鼠的運動能力下降，符合PD小鼠的行為特征，說明造模成功。不同劑量的VD3治療PD小鼠后，中、高劑量組小鼠的運動能力較模型組明顯改善，推測VD3對PD小鼠有治療作用。

α-syn與PD的發病關系密切，α-syn錯誤折疊、異常聚集[1-2]，其是PD典型病理改變路易小體的主要成分。酪氨酸在TH的作用下生成左旋多巴，左旋多巴脫羧生成多巴胺，TH是多巴胺合成的關鍵酶。本研究中PD小鼠給予不同劑量VD3干預后，中、高劑量組PD小鼠黑質α-syn的mRNA及蛋白表達水平下降、TH的mRNA及蛋白表達水平升高，說明VD3通過抑制黑質α-syn、升高TH活性，改善PD小鼠的運動癥狀。從臨床表現到蛋白分子水平，證實VD3對PD小鼠有保護作用。

雖然本研究為VD3治療PD提供了一定的基礎研究結果，但VD3應用于臨床還有待于VD3的藥理作用的深入研究及多中心的臨床研究。α-syn的異常聚集被認為是PD致病的關鍵因素，α-syn通過介導星形膠質細胞功能異常導致血腦屏障破壞，通過小膠質細胞介導炎性因子的釋放，導致多巴胺能神經元的變性死亡。