MAST D73C組合紙片法和PCR基因檢測(cè)兒童碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌菌株中碳青霉烯酶的價(jià)值

黃校樑 李幗寧 何杏欣 莫桂芳 許敏華

佛山復(fù)星禪誠(chéng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528031

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistant，CRE）屬于腸道桿菌，生物學(xué)形狀以及形態(tài)均存在較高的相似度，OXA-48酶、MβL酶、KPC酶等碳青霉烯酶等為腸桿菌科細(xì)菌對(duì)耐碳青霉烯類抗生素的主要機(jī)制，整合子、質(zhì)粒等移動(dòng)元件傳播均可成為傳播介質(zhì)并最終造成菌株CRE暴發(fā)[1-2]。針對(duì)產(chǎn)生不同碳青霉烯酶的CRE菌株需要采用相應(yīng)的藥物治療方案，其中，阿維巴坦可對(duì)A類（ESBL、KPC）、C類（AmpC）以及D類（OXA-48）β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，但對(duì)產(chǎn)生B類金屬酶（NDM、IMP）無(wú)明顯效果[3]。現(xiàn)階段，碳青霉烯類抗生素在臨床上應(yīng)用廣泛且存在濫用現(xiàn)象，兒童體內(nèi)對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)，要求臨床微生物實(shí)驗(yàn)室能夠?qū)μ记嗝顾仡愋瓦M(jìn)行快速且準(zhǔn)確地鑒別，以便為臨床合理選擇抗菌藥物提供指導(dǎo)，以最大程度地抑制CRE傳播[4]。本研究對(duì)象為兒科患者，探討自CRE中分離出的碳青霉烯酶類型及分布情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共計(jì)采集2018年6月至2019年10月非重復(fù)CRE菌株240株，其中，肺炎克雷伯菌183株，大腸桿菌30株，陰溝腸桿菌20株，產(chǎn)氣克雷伯菌7株。CRE為對(duì)超過(guò)1種碳青霉烯類（包括厄他培南、亞胺培南、美羅培南等）存在耐藥現(xiàn)象的腸桿菌科細(xì)菌[5]。菌株鑒定儀器為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（型號(hào)：MALDI-TOF MS），質(zhì)控菌株：大腸桿菌ATCC 25922，來(lái)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器、試劑 儀器包括購(gòu)自德國(guó)Bruker公司的MALDI-TOFMS，購(gòu)自德國(guó)Eppendor公司的PCR擴(kuò)增儀、電泳儀，所用紫外線投射凝膠成像儀型號(hào)為GelDoc2000，由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。試劑包括，Taq酶；購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司的MH平板；dNTPs10×緩沖液，由大連TaKaRa公司生產(chǎn)；由西班牙Biowest公司生產(chǎn)的瓊脂糖；由北京天根公司生產(chǎn)的核酸染料：型號(hào)為Genegreen、DL2000Marker、50×TAE緩沖液、由大連美侖生物公司生產(chǎn)的抗菌藥物粉劑；由英國(guó)MAST公司生產(chǎn)的MAST D73C組合紙片、哥倫比亞血平板。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 碳青霉烯酶基因檢測(cè)方法 通過(guò)煮沸法進(jìn)行細(xì)菌DNA檢測(cè)并以之作為PCR模板[6]，對(duì)碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48-like、blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaBIC、blaSIM）進(jìn) 行 擴(kuò)增，以下為引物序列：基因包括A類β-內(nèi)酰胺酶 基 因：KPC、TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、IBC、GES；B類β-內(nèi)酰胺酶基因：IMP、VIM；C類β-內(nèi)酰胺酶基因：DHA、ACC、FOX；D類β-內(nèi) 酰 胺 酶 基 因：OXA-2、OX1-A（OXA-10）[6]。共計(jì)25 μl反應(yīng)體系，包括1 μl DNA模板、各0.5 μl 20 μmol/L上下游引物、2.5 μl 10×緩 沖 液、2 μl dNTPs及18.375 μl ddH2O。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含Genegreen核酸染料）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并成像（通過(guò)紫外投射凝膠成像系統(tǒng)拍照）成像。針對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序（上海賽音生物技術(shù)有限公司）后將測(cè)序結(jié)果提交至blast網(wǎng)站（https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.2.2 碳青霉烯酶 MAST D73C組合紙片法包括以下方面：將法羅培南歸入至A組，將法羅培南與MβL抑制劑歸入至B組，將法羅培南與KPC抑制劑歸入至C組，經(jīng)法羅培南聯(lián)合AmpC抑制劑歸入至D組，將替莫西林聯(lián)合MβL抑制劑歸入至E組。根據(jù)CLSI M02文件及常規(guī)紙片擴(kuò)散法中相關(guān)操作要求向涂布受試菌的MH平板中放入紙片并輕微按壓，控制孵育溫度為35℃，孵育時(shí)間為18～24 h，然后測(cè)量抑菌圈直徑[7]。陽(yáng)性質(zhì)控菌株：經(jīng)PCR確認(rèn)攜帶blaNDM、blaOXA-232、blaKPC基因的細(xì)菌，陰性質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

比較分析碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果及碳青霉烯酶組合紙片法檢測(cè)結(jié)果。靈敏度=陽(yáng)性菌株數(shù)/（陽(yáng)性菌株數(shù)+陰性菌株數(shù)）×100%，特異度=陰性菌株數(shù)/（陽(yáng)性菌株數(shù)+陰性菌株數(shù)）×100%。檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)為PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)組合紙片法在碳青霉烯酶中的檢測(cè)特異度、靈敏度進(jìn)行計(jì)算并分析與PCR結(jié)果的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，一致性差：Kappa值＜0.4；一致性較好：Kappa值介于0.4～0.75；一致性好：Kappa值＞0.75。Youden指數(shù)范圍介于0～1，指數(shù)越接近1則表明具有越好的真實(shí)性。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果分析

240株CRE中，PCR基因檢測(cè)結(jié)果顯示檢出碳青霉烯酶基因菌株數(shù)量為233株，blaNDM、blaOXA-232、blaKPC-2和blaIMP檢出率分別為40.83%、29.17%、20.83%和4.58%，其中，4株菌株同時(shí)攜帶2種碳青霉烯酶基因，7株菌株未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因。碳青霉烯酶基因檢出情況及不同基因型分布情況見(jiàn)表1。

表1 碳青霉烯酶基因型分布情況分析（n=240）

2.2 碳青霉烯酶組合紙片法檢測(cè)結(jié)果分析

單碳青霉烯酶基因表達(dá)陽(yáng)性的菌株數(shù)量為231株，MAST D73C組合紙片檢測(cè)結(jié)果如下：MβL酶檢出率為47.16%（108/229）、OXA-48酶檢出率為27.07%（62/229）和KPC酶檢出率為8.73%（20/229）。檢測(cè)結(jié)果金標(biāo)準(zhǔn)為PCR檢測(cè)結(jié)果，以MAST D73C檢測(cè)MβL酶及OXA-48酶靈敏度、特異度，靈敏度＞80%，特異度＞95%。Youden指數(shù)、Kappa值表明區(qū)分產(chǎn)MβL酶和OXA-48酶菌株均具有較好的真實(shí)性與一致性。KPC酶檢測(cè)特異度與靈敏度分別為98.85%、32.14%，一致性及真實(shí)性均較差。通過(guò)MAST D73C組合紙片法共計(jì)檢出CRE 39株，無(wú)法對(duì)獲取的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確解釋，PCR確認(rèn)31株CRE產(chǎn)KPC酶菌株、產(chǎn)OXA-48酶CRE數(shù)量為8株。見(jiàn)表2～3。

表2 PCR及MAST D73C在碳青霉烯酶型中的檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 分析組合紙片法在KPC型碳青霉烯酶中的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)

因MAST D73C在KPC型碳?xì)涿钢械臋z測(cè)靈敏度不高，綜合PCR基因檢測(cè)結(jié)果及本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，無(wú)法對(duì)此次檢測(cè)結(jié)果做出準(zhǔn)確解釋，若B-A、C-A及D-A不足5 mm，E超過(guò)10 mm，若對(duì)法羅培南耐藥則可判定為產(chǎn)KPC酶，可使KPC酶檢測(cè)靈敏度得到顯著提高（由32.14%提高至85.71%），特異度為99.43%。本研究中，Youden指數(shù)及Kappa值分別為0.86、0.91，一致性及真實(shí)性均較高，其他酶型的特異度、靈敏度變化不明顯，MAST D73C碳青霉烯酶與PCR檢測(cè)符合率較高，達(dá)91.27%。

表3 MAST D73C在碳青霉烯酶型中的檢測(cè)價(jià)值

3 討論

隨著對(duì)兒童健康和生命造成極大威脅的CRE發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注[8]。在臨床實(shí)踐中掌握碳青霉烯酶種類能為臨床選擇合適的抗生素提供指導(dǎo)，可切斷病原菌傳播途徑并且縮小擴(kuò)散范圍[9]。既往研究中，NDM-1酶在各年齡段人群中均能夠檢出，其中兒童占比較高，而且由于NDM-1酶耐藥性較廣，一旦感染可導(dǎo)致治療難度顯著增加，故而有“超級(jí)細(xì)菌”之稱[10]。KPC酶在成人分離株中的檢出率較高，但是本研究中兒童分離株較少。此外，本研究中OXA-232主要自肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到[11]，它是OXA-48的變體。OXA-48于2001年自土耳其檢出，容易引起流行病傳播，該菌株幾乎對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類以及青霉素類等幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物存在耐藥性[12-13]，故而臨床應(yīng)及時(shí)監(jiān)測(cè)并及時(shí)進(jìn)行有效防控[14]。OXA-48酶常規(guī)表型檢測(cè)存在較高的風(fēng)險(xiǎn)，需要采用其他檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)OXA-48酶菌株，確保能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，常用方法包括改良Hodge試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)等，適宜于基層微生物室中開(kāi)展。

有研究報(bào)道[15]MAST D73C能夠不斷準(zhǔn)確判斷碳青霉烯酶類型，還能夠?qū)XA-48酶、MβL酶及KPC酶進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，但本研究中針對(duì)大部分產(chǎn)KPC酶菌株的CA＜5 mm結(jié)果均無(wú)法獲得準(zhǔn)確解釋，KPC酶檢測(cè)靈敏度僅為32.14%。Youden指數(shù)以及kappa值結(jié)果均表明MAST D73C紙芯片組合能夠準(zhǔn)確區(qū)分MβL、OXA-48產(chǎn)酶菌株，而且具有較高的一致性和真實(shí)性，但是難以準(zhǔn)確區(qū)分KPC產(chǎn)酶菌株（Youden指數(shù)：0.32，kappa值：0.42），原因可能在于KPC酶檢測(cè)靈敏度低并導(dǎo)致可靠性下降，C組紙片中的KPC抑制劑濃度無(wú)法有效抑制碳青霉烯類高度耐藥菌株中的KPC酶作用可能為重要引發(fā)原因。PCR檢測(cè)結(jié)果表明8個(gè)結(jié)果不明確的CRE菌株產(chǎn)生OXA-48酶，可解釋組合紙片檢測(cè)OXA-48類酶檢測(cè)靈敏度低于100%。MAST D73C在KPC酶檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值也存在一定的局限性，表現(xiàn)為檢測(cè)靈敏度低，依照PCR結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)制訂KPC型碳青霉烯酶補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)后能夠使檢測(cè)靈敏度獲得提高，而且不會(huì)影響其他酶型的檢測(cè)特異度及靈敏度，能夠有效指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室實(shí)施此類檢測(cè)。

目前CRE治療難度仍然較大，針對(duì)碳青霉烯類耐藥現(xiàn)象仍然急需創(chuàng)新藥物以有效控制患者病情，保證患者生命安全。鑒定碳青霉烯類既能夠?yàn)榱餍胁W(xué)研究及制訂相關(guān)控制策略提供一定的參考和指導(dǎo)，還能夠指導(dǎo)臨床合理用藥。MAST D73C組合紙片法可指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確判斷碳青霉烯酶類型，有利于臨床合理選擇抗菌藥物。