肽或蛋白質類納米顆粒口服應用的最新研究進展

袁禮穩，劉振利，陳 珍，楊雨婷，張雪花，李露萍，謝書宇

(華中農業大學國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，國家獸藥安全評價實驗室(HZAU)，農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室，武漢 430070)

蛋白質和肽(PPs)已被確定為生命的基本單位，并發展成為治療一系列疾病的藥物。首先，PPs具有一定的治療優勢，比如它們的特異性以及它們的耐受性等；在過去十年中，增強的特異性和耐受性特征擴大了它們的應用。在2000年代初期，研究人員首次進行了用牛和豬的胰島素治療糖尿病的試驗。20年后，研究者們仍花費了大量時間來研究并開發這些生物分子的潛在治療劑作用價值。另外，蛋白質和肽也已成為小分子藥物——核酸的替代品之一，并且會更容易獲得監管機構的批準[1-2]。純藥物級肽源于合成的化學肽(比如乳清蛋白、胰島素等)，這些肽因其具有內在的活性和功能，所以在許多疾病的治療中發揮重要作用，比如癌癥、糖尿病、自身免疫病和心血管疾病[3-4]；除此之外，一些肽還可用作抗微生物劑、抗高血壓劑和抗氧化劑，這些肽被修飾用來靶向許多分子靶標，例如抗菌肽激素受體、蛋白質-蛋白質相互作用和酪氨酸激酶受體等[5-6]。因此，功能化后的肽類藥物可以被顯著的提高其生物利用度。合適的給藥途徑不僅能保證藥物的療效，還能保證患者的依從性。然而，PPs的給藥途徑通常是胃腸外注射，長期連續注射可能對患者依從性構成巨大挑戰，包括疼痛、對注射的厭惡、對針頭大小的擔憂和局部刺激反應明顯等。因此，許多研究團體試圖開發遞送PPs的替代途徑，例如口服、鼻腔、眼部和經皮給藥[7-8]，其中口服遞送是最有吸引力的替代途徑，因為它具有更高的安全性和依從性[9-11]。以口服胰島素為例，口服給藥途徑能夠模擬內源性胰島素的生理命運，這可以實現比皮下注射(SC)更好的葡萄糖穩態[12]。口服給藥途徑將通過改善患者的生理條件來提高治療某些慢性病的治療效果。根據聯合市場研究最近的報告，全球口服PPs市場預計將從2016年的6.43億美元增長到2028年的82.3億美元[13]，因此，提高口服PPs的生物利用度將是眾多研究者重點研究的難題。

1 肽或蛋白質類大分子藥物口服吸收的障礙

胃腸道旨在將碳水化合物、蛋白質和其他營養物質消化成氨基酸和單糖的亞基。同時，胃腸道也是防止病原體進入機體的天然屏障。因此，完整的PPs的口服生物利用度<1%，有時甚至<0.1%[26-27]。事實上，口服給藥的藥物在吸收之前必須克服許多生物學障礙(圖1)。

圖1 口服肽或蛋白質NPs的生物學屏障Fig 1 Biological barrier of oral peptide or protein NPs

1.1 生化屏障 蛋白質或肽類納米顆粒(PP-NPs)存在兩大類生化屏障：胃腸道pH梯度變化提供的屏障和酶促屏障。胃的消化液由胃腺分泌，由鹽酸、蛋白質消化酶、胃蛋白酶和粘液組成。小腸分為三個不同的區域：十二指腸、空腸和回腸，每個區域都具有影響營養吸收的獨特特征[28]。當部分消化的食物和其他顆粒通過胃腸道時，它們會受到從胃(pH 1.0～2.0)到十二指腸(pH 4～5.5)、空腸(pH 5.5～7.0)和回腸(pH 7.0～7.5)，然后轉移到結腸和直腸(pH 7.0～7.5)的腔內pH值變化的影響[29-30]。這種pH梯度變化加上不同的胃排空率和胃腸蠕動，嚴重影響口服PP-NPs在胃腸道的吸收利用[31]。

鹽酸使胃成為體內酸性最強的環境(pH 1～2)。在這種高度酸性的條件下，胃蛋白酶的活性最佳。胃蛋白酶作為一種廣泛的內肽酶，可水解苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族殘基的肽鍵[32]。脂肪、油和甘油三酯的水解也在胃中發生，并由脂肪酶催化。此外，盡管小腸中充滿了各種消化酶，如胰腺分泌的消化酶，常見酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶和彈性蛋白酶，還有小腸的腸細胞產生的幾種氨肽酶、羧肽酶、內肽酶和γ-谷氨酰轉肽酶，因此，PP-NPs要克服這些酶到達下一個部位將面臨嚴峻挑戰[33]。但事實上絕大部分肽或蛋白類藥物在pH梯度變化和各種酶的共同作用下土崩瓦解，致使其生物利用度低。

1.2 粘液屏障 粘液是由杯狀細胞分泌的覆蓋整個胃腸道的粘性凝膠層，可以捕獲外來物質并保護上皮細胞免受外源性病原體的攻擊。整個胃腸道中的粘液由兩層組成，包括疏松易流動的松散層和牢固粘附的粘液層。粘液對PP-NPs進入粘膜下組織施加多重屏障。首先，高粘度降低了PP-NPs在粘液中的擴散性，這直接影響了PP-NPs在粘液中的穿透能力[34]。粘液在腸道中是持續分泌和更新替換的，在腸道中周轉時間約為50～270 min，導致粘液層中捕獲的顆粒被快速去除，從而降低了納米顆粒的粘附和停留時間，使得PP-NPs在到達腸上皮細胞之前滲透穿過粘液層變得非常具有挑戰性[35]。其次，粘蛋白也能一定程度影響PP-NPs的攝取效率，由于粘蛋白中絲氨酸的糖基化以及蘇氨酸和脯氨酸結構域的存在，使粘液中的粘蛋白帶高度負電荷，因此,粘蛋白和PP-NPs之間可能通過靜電力產生更大的相互作用[36]。此外，由于粘蛋白刷狀支架結構，可以作為一種大小顆粒的過濾器，進而降低蛋白質等較大化合物的遷移率[37-38]。另外，由于粘蛋白纖維通過范德華力和靜電力、氫鍵和疏水相互作用與蛋白質或顆粒非共價相互作用，因此可能會發生蛋白質的結構修飾或顆粒的截留，從而阻礙他們的吸收[39-41]。

1.3 細胞屏障 位于粘液下方的腸上皮細胞也是口服PP-NPs遞送的另一個主要限制因素。腸上皮細胞包括各種類型的細胞且具有各自其特定的功能，例如用于吸收的腸細胞、用于分泌粘液的杯狀細胞和用于運輸外來顆粒的M細胞[42]。腸上皮細胞是主要的吸收細胞，大約占90%的腸上皮[43]。這些極化的上皮細胞形成一個連續的單層，將腸腔與下面的固有層分開。

藥物的腸道吸收主要依賴于跨細胞途徑，而細胞旁途徑是一些親水性小分子的主要跨細胞途徑[44]。根據Lipinksi “Rule of 5”，PPs被預測為極低的跨細胞滲透性，因為PPs的Log P很可能遠低于5，并且PPs有大量的氫鍵供體或受體，分子量遠大于500 Da。因此，PPs很難通過跨細胞途徑被吸收到門靜脈中[45]。PP-NPs通過腸上皮細胞，會受到相鄰腸細胞之間的緊密連接蛋白復合物、粘附連接和橋粒的物理限制[46]。這些帶有凈負電荷的蛋白復合物的平均孔隙半徑估計為8-13?[47-48]。因此，它們阻止了大多數離子和大分子在相鄰細胞之間的轉運(稱為細胞旁轉運)。此外，PP-NPs(通常帶電)可以被腸細胞或M細胞主動內化，并通過胞吞作用穿梭到相反的膜上[49]。通過這些方式進入細胞屏障的毒素、外源性化合物和其他外來化合物通過主動運輸機制被排回管腔。因為P-糖蛋白、乳腺癌耐藥蛋白和多藥耐藥蛋白是表達在腸細胞頂膜上的三種外排泵，它們已被證實可以降低在腸道的藥物吸收，從而降低了藥物的生物利用度[50-51]。

2 PP-NPs口服給藥的最新進展

國內外研究人員已經研究了各種聚合物來制造NPs，因此，口服PP-NPs遞送領域在過去幾年中獲得極大發展，包括納米凝膠，微乳液，脂質體，納米顆粒等(表1詳細說明了用于口服的肽或蛋白質類納米顆粒的研究進展)。然而，研究最廣泛和最容易被接受的聚合物本質上是可生物降解的。聚合物的選擇取決于多種因素，例如給藥方式、靶向目的、裝載藥物的理化性質、所需的釋放曲線、所需的顆粒降解速率和生物相容性等[84-85]。此外，使用滲透促進劑促進PP-NPs的吸收是一個重要的研究領域[86]。自20世紀90年代至今， 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚甲基丙烯酸、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、殼聚糖及其衍生物和藻酸鹽等聚合物被用于制備納米顆粒[87]。天然聚合物(明膠、白蛋白和藻酸鹽)也被廣泛用于NPs的制備，但具有一些固有的缺點，例如對降解的敏感性、重現性差和潛在的抗原性[88]。pH敏感的聚合物納米載體也廣泛用于口服PPs的遞送。與基于脂質的納米顆粒相比，聚合物納米顆粒在胃腸道的降解相對于環境中表現出更好的穩定性和保存性[89]。

在脂質納米載體的制備過程中，脂質的選擇是制備納米載體的關鍵因素。通常用于制備脂質納米載體的脂質包括脂肪酸、脂肪醇、磷脂和甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯。脂質賦形劑通過增加腸膜的通透性、減少蛋白水解和增加腸淋巴轉運來增強PPs的吸收[90]。由于胃腸道液體的不穩定性和滲透性差，脂質體作為口服PPs遞送系統尚未取得成功[91]。因此研究人員已經證明了對脂質NPs進行表面修飾以有效加載PPs藥物，在所測試的納米載體中，只有用DSPE-PEG2000修飾的脂質NPs能夠增加小鼠胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的水平(增加八倍)。治療1個月后，該制劑還有效地使糖尿病小鼠的葡萄糖水平正常化[92]。

微乳液是兩種互不相溶的溶劑在表面活性劑的作用下形成乳液，在微泡中經成核、聚結、團聚、熱處理后得納米顆粒。它們在熱力學上是穩定的，并且尺寸小于100 nm。相比之下，納米乳劑在熱力學上不穩定，需要高能量才能產生小于200 nm的動力學穩定系統。微/納米乳液對PPs口服遞送很有前景，因為它們使用簡單的水/油(W/O)乳液或多個W/O/W乳液促進親水肽的溶解[93]。Bilosomes是一種新型脂質納米載體，它含有結合在囊泡脂質雙層中的膽汁鹽。古菌體包含從酸熱硫化葉菌中提取的脂質部分，保護胃腸道中的肽，并保留肽更長時間(12 h)。固體脂質納米顆粒(SLN)親脂性膠體載體由生理脂質和表面活性劑組成。SLN的優點包括使用無毒溶劑、避免化學交聯和具有較高的藥物負載效率[94]。當SLN分散在GI流體中時發生自乳化制劑被稱為自乳化藥物遞送系統(SEDDS)。納米顆粒尺寸小于200 nm的系統稱為SNEDDS或納米乳液。這是極具發展前景的納米遞送系統，因為它們可以包裝成膠囊，為患者提供靶部位的精確給藥[95]。SNEDDS用于配制親脂性和水溶性差的藥物，目前的應用包括控制藥物的釋放、提高藥物穩定性和增加載藥量(25 mg～2 g)[96]。

NPs也可以使用各種無機、有機以及有機和無機材料的混合物合成。陶瓷和磷酸鈣被廣泛用于制備用于各種治療適應癥的納米顆粒。一項研究表明，較小尺寸(≤200 nm)和更多負電荷(例如二氧化硅)的NPs表現出更好的腸道通透性[97]。然而，無機NPs用于口服給藥是受限制的，它們在體內緩慢和/或部分降解，因此,可能會積聚在身體組織中。因此，要了解與使用無機NP相關的毒理學問題，需要進一步升入研究和探索[98]。

表1 用于口服的肽或蛋白質類納米顆粒Tab 1 Peptide or protein nanoparticles for oral administration

3 展 望

納米技術已成為醫學領域的重要參與者，最近批準的NP數量越來越多[99-101]。令人興奮的是，大量NPs正在進行臨床試驗研究，這反映了通過基于納米的方法治療人類疾病的重要性。在各種NPs中，蛋白質NPs是高度優選的，主要是因為它們具有高特異性、耐受性和生物降解性。蛋白質NPs能夠裝載各種藥物，以便在不同的器官中進行特異性遞送。這種遞送可以通過口腔、鼻腔、肺部、靜脈內和眼部途徑介導，其中口服遞送可提供最高程度的患者依從性和舒適度。用于口服給藥的蛋白質NP的開發為人類疾病治療開辟了新途徑。然而，大多數口服納米給藥系統的研究仍處于實驗室階段，面臨許多挑戰：如何增加載藥量以達到臨床治療劑量；開發成便于臨床使用的劑型；安全評估和穩定性研究。因此，為了找到克服挑戰的實用和有效的方法，將進行更深入的研究是必要的。