山楂葉質量評價研究

段麗穎，任欠欠，杜義龍，李艷榮，趙勝男，潘海峰

（承德醫學院，河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000）

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br 或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥葉，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效，收錄于2020 年版《中國藥典》［1］中，常用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病［2］。現代研究表明，山楂葉富含黃酮類、萜類、有機酸等化合物［3］，其中總黃酮是其發揮抗動脈粥樣硬化、降壓降脂、增加冠脈血流量等作用的主要活性成分［4-5］，并且在改善糖脂代謝紊亂、降低血糖血脂方面也發揮著重要作用［6-7］，但對其降低血糖方面的研究尚不完善。

中藥所含化學成分較為復雜，指紋圖譜可反映其整體性［8］，同時借助聚類熱圖能以更直觀的方式展現數據疏密、樣品地區差異的變化，并且通過化學計量學方法可進行全面質量評價［9］。因此，本實驗以體外抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性試驗考察山楂葉降糖作用，同時建立不同產地樣品UPLC 指紋圖譜，并采用雙變量相關分析、熱圖、聚類分析、主成分分析對該藥材進行質量評價，以期為其產地區分及質量研究提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Multiskan FC 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；JA5003 上皿天平（千分之一，天津天馬衡基儀器有限公司）；AG245電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DHG-9070A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；WIGGENS TM-1 渦旋振蕩器（北京桑翌實驗儀器研究所）；HC-2062 高速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；KQ-700 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TCP-010-096潔特細胞培養板（廣州潔特生物過濾股份有限公司）；實驗室PH 計［瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；FW100 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；MH-2 微型振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 α-淀粉酶（豬胰腺）（批號RM19Y304）、α-葡萄糖苷酶（批號RM20Y1225）、對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，批號RM20Y807）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；阿卡波糖（批號113HO31，北京索萊寶科技有限公司）；淀粉（批號RM1248-50KU，天津市光復精細化工研究所）。

綠原酸（批號18071907）、牡荊素葡萄糖苷（批號 20042305）、牡荊素鼠李糖苷（批號18060103）、牡荊素（批號16070601）、蘆丁（批號18122901）、金絲桃苷（批號19103001）、異槲皮素（批號18062702）對照品均購自成都普菲得生物技術有限公司。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸為分析純；水為純凈水（批號JYSPYL2027，杭州娃哈哈集團有限公司）。

山楂葉共15 批，于2020 年11 月采自全國各地，經全國老中醫藥專家（傳統鑒定）學術經驗繼承人孫寶惠主任藥師鑒定為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br的干燥葉，均符合2020 年版《中國藥典》 一部項下要求，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 UPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品溶液 山楂葉經粉碎機粉碎后過80 目篩，取約1.0 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 60%甲醇，稱定質量，密封，超聲處理30 min 后靜置15 min，60%甲醇補足減失的質量，12 000 r／min 離心10 min，取上層清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得（質量濃度約為20 mg／mL）。

2.1.1.2 對照品溶液 精密稱取綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素對照品適量，50%甲醇溶解，制成質量濃度分別為38.13、10.28、14.02、5.73、8.52、5.95、8.52 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相水（含0.1%甲酸）（A）-（乙腈-四氫呋喃-甲酸）（120∶10∶0.1）（B），梯度洗脫（0～6 min，92%～89%A；6～10 min，89%～83% A；10～15 min，83%～83.5%A；15～18 min，83.5%～80%A；18～20 min，80%～66%A；20～22 min，66%～0A；22～24 min，0A）；體積流量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長340 nm；進樣量2 μL；樣品室溫度25 ℃。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液（S2），在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各共有峰相對峰面積RSD 均小于3%，相對保留時間RSD 均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.2 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對峰面積RSD 均小于3%，相對保留時間RSD 均小于1%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.3.3 重復性試驗 取同一批藥材（S2），按“2.1.1.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對峰面積RSD 均小于3%，相對保留時間RSD均小于1%，表明該方法重復性良好。

2.1.4 圖譜生成 取對照品、供試品溶液適量，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，以S1 圖譜為參照，設置時間窗寬度為0.2 min，多點校正后采用中位數法生成指紋圖譜（圖1），以穩定性較好的23 個色譜峰為共有峰。再采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A 版）對15 批樣品進行相似度評價，結果見表2。然后，通過對照品色譜圖（圖2）對共有峰進行指認，確定5、16、18、19、21、22、23 號色譜峰分別為綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素。

圖1 15 批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints for fifteen batches of samples

表2 15 批樣品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

圖2 對照品UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of reference substances

2.2 降糖活性研究 參考文獻［10］報道，并對實驗條件稍加調整。

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 樣品溶液 取“2.1.1.1” 項下供試品溶液續濾液1 mL 至蒸發皿中，水浴蒸干后以等體積PBS 緩沖液（pH 6.8）復溶，即得（質量濃度約為20 mg／mL）。

2.2.1.2 阿卡波糖溶液 稱取阿卡波糖（陽性藥）適量，PBS 緩沖液溶解，得1 mg／mL 母液，PBS 緩沖液稀釋成系列質量濃度，即得。

2.2.2 α-淀粉酶活性抑制實驗 取20 μL 不同質量濃度樣品溶液至1 mL 離心管中，再加入20 μL 0.35 U／mL α-淀粉酶溶液，渦旋5 s 并瞬時離心后在37 ℃下孵育15 min，加入20 μL 0.15%淀粉溶液，渦旋離心，在37 ℃下孵育15 min，加入80 μL DNS 溶液終止反應，煮沸5 min 后冰水浴冷卻至室溫，將離心管內的溶液轉移至96 孔板中，酶標儀上于540 nm 波長處檢測吸光度值，每個質量濃度平行3 份，作為樣品組；以等體積PBS 緩沖液代替α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作為樣品對照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品溶液，其他操作同上，作為對照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品、α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作為空白組；以等體積不同質量濃度阿卡波糖溶液代替樣品溶液，其他操作同上，作為陽性對照組，計算抑制率，公式為抑制率（%）＝｛［（對照組吸光度－空白組吸光度）－（樣品組吸光度－ 樣品對照組吸光度）］／（對照組吸光度－ 空白組吸光度）｝ × 100%，再將數據導入SPSS 21.0 軟件計算IC50值，結果見表3。

表3 α-淀粉酶雙變量相關分析、色譜峰篩選、IC50值、主成分評分Tab.3 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for αpancreatic amylase

2.2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗 在96 孔板中加入60 μL PBS 溶液，再加入20 μL 不同質量濃度樣品溶液、20 μL 0.5 U／mL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，37 ℃孵育15 min；加入20 μL 2.5 mmol／L PNPG 繼續孵育15 min，加入80 μL 0.2 mol／L 碳酸鈉終止反應，酶標儀上于405 nm 波長處測定吸光度值，每個質量濃度平行3 份，作為樣品組；以等體積PBS 緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液，作為樣品對照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品、α-葡萄糖苷酶溶液，作為空白組；其余同“2.2.2”項分組，按“2.2.2” 項下公式計算抑制率及IC50值，結果見表4。

表4 α-葡萄糖苷酶雙變量相關分析、色譜峰篩選、IC50值、主成分評分Tab.4 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for α-glucosidase

2.2.4 結果分析 由表3～4 可知，樣品對α-淀粉酶有一定抑制作用，但弱于阿卡波糖，而在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面與阿卡波糖相當，甚至更優；對2 種酶活性的抑制效果與產地呈現一定相關性，其中河北、遼寧產樣品優于山東、山西產樣品。

2.3 統計分析

2.3.1 雙變量相關分析 以23 個共有峰峰面積及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的IC50值為原始數據，導入SPSS 21.0 軟件中進行雙變量相關分析，分別篩選出與抑制α-淀粉酶活性顯著相關（P＜0.05），并符合KMO 檢驗（KMO＞0.5）、Bartlett 球形檢驗（P＜0.05）的13 個色譜峰，作為α-淀粉酶組；與抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著相關，并符合相關檢驗標準的14 個色譜峰，作為α-葡萄糖苷酶組，結果見表3～4。

2.3.2 熱圖繪制 將色譜峰峰面積導入MetaboAnalyst 5.0 平臺（https：／ ／www.metaboanalyst.ca／），選擇“Statistical Analysis” 模塊，對數據進行篩選、歸一化等操作，輸出熱圖，結果見圖3。由此可知，2 個熱圖結果具有相似性，并呈現一定聚類特征，整體上可分為3 類，河北、遼寧產樣品在成分含量上相似性較高，可聚為一類；山西、山東產樣品與河北、遼寧產樣品在成分含量上具有較大差異，分別聚為一類。

圖3 樣品熱圖Fig.3 Heat maps of samples

2.3.3 主成分分析 采用SPSS 21.0 軟件對色譜峰進行KMO 檢驗、Bartlett 球形檢驗，其中α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶KMO 度量值分別為0.789、0.642，Bartlett 球形檢驗P值均小于0.001，提示各變量間存在顯著相關性，可進行主成分分析。按照對應特征值＞1 的原則提取主成分，α-淀粉酶提取1 個主成分，累積方差貢獻率達85.886%；α-葡萄糖苷酶提取2 個主成分，第一主成分特征值為10.549，貢獻率為75.353%，而第二主成分特征值為1.657，貢獻率為11.834%，累積方差貢獻率達87.187%。結合初始因子載荷矩陣（表5）及公式Fi＝A×ZX（A為特征向量矩陣，ZX 為標準化數據矩陣）計算主成分得分，再結合各成分貢獻率建立評分模型，分別為Fα-淀粉酶組＝0.859 ×F1、Fα-葡萄糖苷酶組＝0.753×F1＋0.118×F2，并進行排序，結果見表3～4。由此可知，2 種酶主成分評分排序一致，均以河北、遼寧產樣品較高，排名靠前；山東、山西產樣品較低，排名靠后。

表5 初始因子載荷矩陣Tab.5 Loading matrices for initial factors

3 討論

本實驗對流動相組成進行考察，主要關注有機相乙腈，因其分離度不好，故加入不同比例的四氫呋喃以使分離度得到改善，同時峰形不理想，故又加入一定比例的甲酸得以改善。最終確定，最優流動相為水（含0.1%甲酸）-［乙腈-四氫呋喃-甲酸（120∶10∶0.1）］，此時各成分分離效果最好，并且可改善前期由于流動相混合不充分導致的色譜峰前延問題。

由表3～4 可知，山楂葉對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著優于α-淀粉酶，峰1、2、4、5（綠原酸）、7、9、11、18（牡荊素鼠李糖苷）、21（蘆丁）與抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性均具有顯著相關性，并且α-葡萄糖苷酶相關性系數普遍高于α-淀粉酶。另外，5 號峰（綠原酸）、16 號峰（牡荊素葡萄糖苷）、18 號峰（牡荊素鼠李糖苷）、19 號峰（牡荊素）、21 號峰（蘆丁）、22 號峰（金絲桃苷）、23 號峰（異槲皮素）與抑制α-葡萄糖苷酶活性均顯著相關，并且大多存在單糖、寡糖結構，具有α-葡萄糖苷酶抑制劑化學結構特征［11-12］，可能是山楂葉抑制α-葡萄糖苷酶活性優于α-淀粉酶的原因。

河北、遼寧產山楂葉對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果略高于山東、山西產，其原因可能與經緯度有關。本實驗中15 批樣品采收于河北承德、遼寧葫蘆島、山東臨沂、山西運城，其中河北承德樣品采自北緯40°29′57″、東經117°26′38″；遼寧葫蘆島樣品與其接近，為北緯40°37′10″、東經119°40′22″；山東臨沂、山西運城樣品經緯度相近，分別為北緯35°27′2″、東經117°59′10″及北緯35°20′58″、東經111°10′38″。體外降糖實驗結果顯示，山楂葉分組趨勢與緯度信息有較高的相關性，并且其產地的海拔、日照時間、氣溫、降水量等因素可能會影響黃酮含量，進而影響體外降糖試驗結果。

4 結論

本實驗根據山楂葉對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其UPLC 指紋圖譜的共有峰數據進行雙變量相關分析，采用主成分分析進行綜合評分，發現所得結果與體外降糖實驗結果相互印證，表明該方法科學可靠，可用于山楂葉產地區分、體外降糖效果評價，也能為今后全面評價該藥材質量提供數據支持及方法參考。