生、酒五味子對(duì)失眠小鼠神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)的影響及機(jī)制 Δ

王瑞英 ，蘇 丹 ，李惠珍 ，劉亞麗 ，朱根華 ，楊 明 ，艾志福 ，羅 濤 ，薛 冰 ，宋永貴 [.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治認(rèn)知障礙腦疾病江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥藥效（防治精神障礙腦疾病）評(píng)價(jià)江西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室/抑郁癥中醫(yī)證候動(dòng)物模型江西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，南昌 000；.南昌醫(yī)學(xué)院藥效與安全性評(píng)價(jià)江西省衛(wèi)生健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/抗炎類(lèi)中藥藥效與質(zhì)量評(píng)價(jià)江西省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，南昌 000；.江西古香今韻大健康產(chǎn)業(yè)有限公司，南昌 009；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液凈化中心，南昌 000]

隨著工作和生活壓力越來(lái)越大，睡眠障礙已成為現(xiàn)代人不可忽視的健康隱患，全世界有30%～40%的人有睡眠問(wèn)題[1]。長(zhǎng)期的失眠會(huì)給人體造成活動(dòng)障礙，使人體的記憶力退化，甚至?xí)鹄夏臧V呆等疾病[2]。中醫(yī)以其獨(dú)特的視角，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已對(duì)人的睡眠生理有了較完整的認(rèn)識(shí)，在2 000多年的臨床實(shí)踐中，探索出了獨(dú)具特色、安全性高、效果良好的藥物。中藥五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神的功效[3]。五味子臨床應(yīng)用極為廣泛，其單體、木脂素、提取物均具有改善失眠的作用[4―6]。同時(shí)，五味子與其他藥物組合，可治療各種類(lèi)型的失眠，失眠經(jīng)典方劑天王補(bǔ)心丹及養(yǎng)心安神丸中均含有五味子[7―8]。

由于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控作用，作用機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于生、酒五味子對(duì)失眠的具體影響尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。近年來(lái)的研究顯示，睡眠時(shí)相與神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)的間接調(diào)控密不可分[9]。神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)將神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)相互之間的調(diào)節(jié)關(guān)系作為動(dòng)態(tài)性整體進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，并以細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)作為信息分子來(lái)實(shí)現(xiàn)人體整體功能的調(diào)控[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)探索生、酒五味子改善睡眠的作用機(jī)制，以期為五味子防治睡眠障礙性疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠50只，3周齡，體質(zhì)量（10±2） g，購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（豫）2020?0005。小鼠飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2017?0004。小鼠于12 h光暗周期、室溫20～22 ℃、相對(duì)濕度45%～65%的安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，可自由飲水和進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)：JZLLSC20210061。

1.2 主要藥物及試劑

木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)購(gòu)自長(zhǎng)春市一品根源參茸特產(chǎn)有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)岐黃國(guó)醫(yī)書(shū)院主管藥師吳蜀瑤鑒定為北五味子。地西泮片（批號(hào)H31021151，規(guī)格2.5 mg）購(gòu)自上海上藥信誼藥廠(chǎng)有限公司。時(shí)鐘基因Bmal1、生物鐘基因Clock、周期基因Per2、內(nèi)參甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計(jì)；兔源腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）抗體（批號(hào)60291?1?Ig）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)Ezz?AB?1055）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；兔源白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL?1β）抗體（批號(hào)ab300499）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）對(duì)照品（批號(hào)51?41?2，純度98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；對(duì)乙酰氨基酚（acetamino‐phen，ACE）對(duì)照品、γ?氨基丁酸（gamma?aminobutyric acid，GABA）對(duì)照品、多巴胺（dopamine，DA）對(duì)照品、谷氨酸（glutamic acid，Glu）對(duì)照品、5?羥色胺（5?hydroxy‐tryptamine，5?HT）對(duì)照品、皮質(zhì)醇（cortisone，CORT）對(duì)照品、甲狀腺素對(duì)照品（批號(hào)分別為B20338、B21979、B25300、S10067、S38336、B21001、S20192，純度分別為99%、99%、98%、98%、98%、98%、98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；牙科水泥及其自凝水溶劑均購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；抗熒光淬滅封片液、4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色液（批號(hào)分別為16D26C36、16I29C76）均購(gòu)自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

XR?XZ301S型SMART 3.0動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司；63001型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀購(gòu)自瑞士Roche公司；TCS SP8型激光共聚焦顯微系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；68003型腦立體定位儀購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；UltiMate 3000型超高效液相色譜儀購(gòu)自日本島津公司；Triple TOF 5600型串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Sciex公司；小鼠腦電、肌電記錄監(jiān)測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Pinnacle公司。

2 方法

2.1 生、酒五味子提取物的制備

生五味子提取物的制備：將五味子干燥成熟果實(shí)用8倍量的水每次提取2 h，共提取3次，在真空中濃縮成浸膏，在冷凍干燥機(jī)中干燥浸膏，在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞莆逦蹲影凑杖缦聜鹘y(tǒng)工藝進(jìn)行制備：取五味子干燥成熟果實(shí)，加黃酒（每100 kg生品五味子加黃酒20 kg）拌勻，稍悶，置蒸器內(nèi)（密封）蒸至上大汽，當(dāng)五味子表面顯示紫黑色后，放入干燥箱中60 ℃徹底干燥后獲得酒五味子；將制得的酒蒸五味子用8倍量的水每次提取2 h，共提取3次，在真空中濃縮成浸膏，在冷凍干燥機(jī)中干燥浸膏，在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模與給藥

50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、地西泮組（陽(yáng)性對(duì)照）、生五味子組、酒五味子組，每組10只。除空白組外，其余4組小鼠按0.47 mg/kg腹腔注射甲狀腺素溶液進(jìn)行造模。當(dāng)小鼠出現(xiàn)活動(dòng)次數(shù)增加、易激惹、晝夜節(jié)律缺失、白天與夜晚活動(dòng)不間斷等行為表示造模成功[11]。每天造模結(jié)束后，生五味子組、酒五味子組小鼠分別灌胃生、酒五味子溶液各0.85 g/（kg·d）[12]，地西泮組小鼠灌胃地西泮1 mg/（kg·d）[13]，空白組和模型組小鼠給予等體積的生理鹽水，所有小鼠每日灌胃1次，共持續(xù)35 d。

2.3 小鼠一般狀態(tài)觀察

每日觀察小鼠外觀（毛發(fā)色澤、光亮度、稀疏程度）、神態(tài)（精神狀態(tài)、意識(shí)狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度）、活動(dòng)、食欲等一般狀況。

2.4 小鼠自主活動(dòng)測(cè)試

灌胃給藥第35 d后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，將小鼠放置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱的中心區(qū)域進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試時(shí)間4 min，前1 min為適應(yīng)期，記錄3 min內(nèi)小鼠總活動(dòng)距離及直立次數(shù)。

2.5 小鼠睡眠時(shí)相監(jiān)測(cè)

將小鼠麻醉，用腦立體定位儀固定，充分暴露顱骨，鉆孔，將與記錄電極連接的不銹鋼螺絲釘植入顱骨相應(yīng)位置及背部頸肌。在12 h/12 h的明暗光照條件下，采用小鼠腦電、肌電記錄監(jiān)測(cè)系統(tǒng)錄小鼠的腦電、肌電信號(hào)。記錄結(jié)束后，根據(jù)統(tǒng)一設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)掃描記錄的信號(hào)，自動(dòng)判別出覺(jué)醒期（wake）、非快速眼動(dòng)睡眠期（non?rapid eye movement，NREM）和快速眼動(dòng)睡眠期（rapid eye movement，REM），計(jì)算出各自所占時(shí)間比。

2.6 實(shí)驗(yàn)取材

各組小鼠完成睡眠時(shí)相監(jiān)測(cè)后，用0.5%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，斷頭取腦，冰上分離小鼠腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）組織，一部分置于液氮速凍，并于24 h內(nèi)移至－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠种糜?%多聚甲醛溶液中固定備用。

2.7 小鼠腦SCN組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測(cè)

2.7.1 腦SCN組織樣本的制備 稱(chēng)取“2.6”項(xiàng)下小鼠腦SCN組織，按質(zhì)量體積比1∶2加入預(yù)冷生理鹽水制成腦勻漿后，取勻漿液 100 μL，加入 360 μL 乙腈和 20 μL ACE（內(nèi)標(biāo)）。在4 ℃以15 000 r/min 離心15 min，吸取上清液100 μL于進(jìn)樣小瓶中，放入冰箱保存，用于超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜分析。

2.7.2 色譜條件 色譜條件為Welch C18柱（1.7 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為 0.01%甲酸水溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0.001～1 min，2%B；1～4 min，2%B→30%B；4～10 min，30%B→90%B；10～10.1 min，90%B→100%B；10.1～13 min，100%B；13～13.1 min，100%B→5%B）。進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40 ℃。

2.7.3 質(zhì)譜條件 以正離子多反應(yīng)檢測(cè)模式進(jìn)行掃描。各神經(jīng)遞質(zhì)及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)信息見(jiàn)表1。

表1 小鼠腦SCN組織中各神經(jīng)遞質(zhì)及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

2.8 小鼠腦SCN組織中IL?1β、TNF?α表達(dá)檢測(cè)

取“2.6”項(xiàng)下4%多聚甲醛溶液中固定的小鼠腦SCN組織，依次進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫水，加入IL?1β一抗、TNF?α一抗（稀釋度分別為1∶500、1∶100），孵育過(guò)夜，次日用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1∶100），室溫孵育15 min；加入DAPI染液染色，PBS沖洗，防熒光猝滅劑封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍（×400）視野，使用Image J軟件對(duì)免疫熒光圖片進(jìn)行處理并計(jì)算熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度＝該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積。綠色熒光代表目的蛋白的表達(dá)，藍(lán)色熒光代表DAPI。

2.9 小鼠腦SCN組織中Bmal1 1、Clock、Per 22 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。取“2.6”項(xiàng)下－80 ℃凍存的小鼠腦SCN組織，先用Trizol提取總RNA，并檢測(cè)總RNA濃度及純度。取總RNA適量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s，然后分三步反應(yīng)，即94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)，用以檢測(cè)Per2、Bmal1、ClockmRNA的表達(dá)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，并以GAPDH為參照基因，各基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

表2 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 6.0處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD?t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 生、酒五味子對(duì)小鼠一般狀態(tài)的影響

空白組小鼠精神狀態(tài)良好、動(dòng)作反應(yīng)靈敏，比較溫和，飲食和飲水正常，毛發(fā)色澤光亮，晝夜節(jié)律正常。與空白組比較，模型組小鼠精神狀態(tài)相對(duì)萎靡，對(duì)外界刺激敏感，容易激怒和受驚，飲食量和飲水量增加，體質(zhì)量降低，毛發(fā)粗糙無(wú)光澤，晝夜節(jié)律出現(xiàn)不規(guī)律現(xiàn)象。與模型組比較，生五味子組、酒五味子組和地西泮組小鼠精神狀態(tài)較好，飲食量和飲水量降低（接近空白組），毛發(fā)色澤有少量不光澤，晝夜節(jié)律相對(duì)得到改善。

3.2 生、酒五味子對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

與空白組比較，模型組小鼠總活動(dòng)距離、直立次數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，地西泮組小鼠總活動(dòng)距離、直立次數(shù)均顯著增加（P＜0.01）；酒五味子組、生五味子組小鼠的直立次數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠自主活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝10）

3.3 生、酒五味子對(duì)小鼠睡眠時(shí)相的影響

與空白組比較，模型組小鼠wake所占時(shí)間比顯著上升（P＜0.05），NREM、REM所占時(shí)間比顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，地西泮組、酒五味子組小鼠wake所占時(shí)間比顯著下降（P＜0.05），地西泮組、酒五味子組、生五味子組小鼠NREM所占時(shí)間比顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠睡眠時(shí)相的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝10）

3.4 生、酒五味子對(duì)小鼠腦SCN組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠腦SCN組織中5?HT含量顯著降低（P＜0.05），NE、DA、CORT含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地西泮組和酒五味子小鼠腦SCN組織中GABA、5?HT含量均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），酒五味子組小鼠腦SCN組織中DA、CORT含量顯著降低（P＜0.01），生五味子組小鼠腦SCN組織中CORT含量顯著降低（P＜0.01）；地西泮組小鼠腦SCN組織中DA、CORT、NE含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠腦SCN組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝10）

3.5 生、酒五味子對(duì)小鼠腦SCN組織中IL?1β、TNF?α表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠腦SCN組織中IL?1β、TNF?α的綠色熒光表達(dá)較強(qiáng)，熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地西泮組、酒五味子組小鼠給藥后綠色熒光表達(dá)減弱，熒光強(qiáng)度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 各組小鼠腦SCN組織中TNF?α表達(dá)的顯微圖（免疫熒光，×400）

圖5 各組小鼠腦SCN組織中IL?1β表達(dá)的顯微圖（免疫熒光，×400）

圖6 各組小鼠腦SCN組織中TNF?α、IL?1β熒光強(qiáng)度結(jié)果（±s，n＝10）

3.6 生、酒五味子對(duì)小鼠腦SCN組織中Bmal 11、Clock、Per2 2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠腦SCN組織中Bmal1、ClockmRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），Per2mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，地西泮組和酒五味子組小鼠腦SCN組織中Bmal1、ClockmRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），地西泮組小鼠腦SCN組織中Per2mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠腦 SCN 組織中 Bmal1 1、Clock、Per2 2 mRNA表達(dá)結(jié)果（±s，n＝10）

4 討論

五味子，又名山花椒、玄及、會(huì)及等，為中醫(yī)臨床常用中藥材[14]，《神農(nóng)本草經(jīng)》列其為上品，《醫(yī)林纂要》中記載“寧神，除煩渴，止吐衄，安夢(mèng)寐”。酒五味子為五味子經(jīng)黃酒蒸制而成的炮制加工品，最早記載于宋代《圣濟(jì)總錄》，曰“用酒三升浸三日取出焙干”[15]。五味子酒制旨在借酒行藥勢(shì)，增強(qiáng)其滋腎功效，常用于心腎虛損、心悸失眠。

目前，大部分促睡眠藥物的藥效評(píng)價(jià)采用戊巴比妥鈉翻正反射實(shí)驗(yàn)，其關(guān)鍵的判斷指標(biāo)為翻正反射消失，但手動(dòng)翻正動(dòng)物這一操作對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定主觀影響[16]。腦電圖是評(píng)價(jià)睡眠效率的金指標(biāo)。NREM和REM是睡眠時(shí)相中的2個(gè)重要階段，這2類(lèi)睡眠的數(shù)量決定了睡眠的質(zhì)量[17]。本研究通過(guò)睡眠時(shí)相發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠NREM和REM所占時(shí)間比顯著減少，給予生、酒五味子治療后，NREM和REM所占時(shí)間比顯著增加。這表明生、酒五味子可通過(guò)增加NREM和REM所占時(shí)間比延長(zhǎng)睡眠時(shí)間。

失眠，并非單一因素所致，涉及神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等多種因素。神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)之間借助于神經(jīng)遞質(zhì)、免疫細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等連接成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，共同發(fā)揮抑制或促進(jìn)睡眠的作用。失眠會(huì)顯著引起神經(jīng)?內(nèi)分泌系統(tǒng)的下丘腦?垂體?腎上腺（hypothalamic?pituitary?adrenal，HPA）軸變化[18]，睡眠障礙與HPA軸過(guò)度活躍有關(guān)[19]。與睡眠主要相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)5?HT可以直接支配下丘腦室旁核分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，影響HPA軸功能，GABA的增加則會(huì)抑制促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的釋放；此外，HPA軸上的促腎上腺皮質(zhì)激素在DA和組胺濃度增加時(shí)，會(huì)促進(jìn)其釋放[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一方面，酒五味子可以顯著提高失眠小鼠腦SCN組織中GABA、5?HT的含量，降低DA、CORT含量。另一方面，經(jīng)生、酒五味子治療后，反映HPA軸興奮程度的CORT含量顯著降低，表明二者可通過(guò)降低CORT含量，負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA軸而促睡眠。綜合來(lái)看，生、酒五味子的促睡眠作用與對(duì)神經(jīng)?內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控密不可分。同時(shí)，神經(jīng)?內(nèi)分泌系統(tǒng)還受免疫系統(tǒng)的調(diào)控，通過(guò)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子和激素樣物質(zhì)反作用于神經(jīng)?內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控睡眠。參與該調(diào)控的細(xì)胞因子有六大類(lèi)，其中TNF?α、IL?1β與睡眠調(diào)控緊密相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生、酒五味子均可降低小鼠腦SCN組織中TNF?α和IL?1β的表達(dá)，結(jié)合其對(duì)REM和NREM所占時(shí)間比的延長(zhǎng)，提示生、酒五味子的促睡眠作用不僅涉及神經(jīng)?內(nèi)分泌系統(tǒng)，還與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，其中潛在的神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫多靶點(diǎn)作用有待后續(xù)進(jìn)一步探究。

此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)給予生、酒五味子后，位于下丘腦SCN的興奮性調(diào)節(jié)基因Clock、Bmal1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降，維持睡眠穩(wěn)態(tài)的基因Per2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高。有研究報(bào)道稱(chēng)，生物鐘相關(guān)基因Clock、Bmal1可以引起神經(jīng)興奮性減弱，同時(shí)影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，伴隨多巴胺能神經(jīng)元活性減少[21]，導(dǎo)致睡眠時(shí)間延長(zhǎng)。但生、酒五味子改善睡眠是否與生物鐘有關(guān)及其具體機(jī)制，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，生、酒五味子對(duì)失眠小鼠有一定的治療效果，其機(jī)制可能與調(diào)控失眠小鼠神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)有關(guān)。