藏藥長梗金腰中2個活性成分的提取富集工藝研究 Δ

黎運芬 ，陳思 ，尼珍 ，向佳美 ，慕澤涇 ，朱玉野 ，龔淑芳 ，任剛 （.江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，南昌 0004；.西藏自治區食品藥品檢驗研究院，拉薩 850000；.江西中醫藥大學附屬醫院國醫堂，南昌 0004）

長梗金腰Chrysosplenium axillareMaxim.為虎耳草科金腰屬多年生草本植物，主產于陜西、甘肅南部、青海東南部和新疆等地，生于海拔2 800～4 700 m的林下、灌叢間或石隙。據《中國藏藥植物資源考訂》記載，長梗金腰為特色藏藥“亞吉瑪”的基原植物之一[1]。長梗金腰以干燥全草入藥，其味苦性涼，清膽熱，祛膽病[2]，用于治療膽病引起的發燒頭痛、膽囊疾患、急性黃疸型肝炎等癥[3]。本課題組前期研究采用肝內膽汁淤積 （intrahe‐patic cholestasis，IC）模型小鼠驗證了長梗金腰抗IC的功效，并從中分離得到了2個高度甲氧基化的黃酮醇衍生物——chrysosplenoside A（CA）和 chrysosplenoside I（CI）[4]；并發現這2種成分對IC模型小鼠的肝損傷具有保護作用，且優于熊去氧膽酸（目前臨床治療IC的一線藥物）。由此可見，CA、CI作為抗IC藥物具有良好的開發前景?；诖耍狙芯砍跆介L梗金腰中CA、CI的提取富集工藝，以期為CA、CI的藥物開發提供物質基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有EX1600型高效液相色譜（HPLC）儀（上海伍豐科學儀器有限公司）、CP?214型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）、KQ?5200DB型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、GOLD?SIM型冷凍干燥機（美國Siemon公司）、R?210型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 藥品與試劑

長梗金腰藥材于2018年7月采集自四川省壤塘縣中壤塘鄉，經江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心鐘國躍研究員鑒定為長梗金腰C.axillareMaxim.全草。CA、CI標準品為本實驗室自制，純度經HPLC檢測均大于98%。HPD?500型和D101型大孔吸附樹脂購自滄州寶恩化工有限公司；Diaion HP?20型大孔吸附樹脂購自日本三菱化學公司；色譜級乙腈購自德國Merck公司；質譜級乙酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑為實驗室常用規格。

2 方法與結果

2.1 CA和CI含量測定方法的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取干燥長梗金腰全草適量，粉碎過三號篩，取0.5 g粉末，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，稱定質量；超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理45 min，取出放冷，稱定質量；以50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，備用。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取CA、CI對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質量濃度分別為0.420 0、0.360 0 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS?2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%乙酸溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，10%B→20%B；10～20 min，20%B→25%B；20～40 min，25%B→40%B；40～50 min，40%B→50%B；50～60 min，50%B→80%B；60～70 min，80%B→95%B）；流速為0.8 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

2.1.4 專屬性考察 取“2.1.1”“2.1.2”項下供試品溶液和混合對照品溶液適量，按“2.1.3”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液和混合對照品溶液圖譜中CA和CI的保留時間一致，且分離度均大于1.5。結果見圖 1。

圖1 供試品溶液和混合對照品溶液的HPLC圖

2.1.5 線性關系考察 取“2.1.2”項下制備的混合對照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇分別稀釋2、4、8、16、32、64倍后得到系列對照品溶液；按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以進樣量（μg）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得CA和CI的回歸方程；再以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限和檢測限。結果見表1。

表1 CA和CI的線性關系及靈敏度考察結果

2.1.6 精密度試驗 取同一供試品溶液適量，按“2.1.3”項下色譜條件重復測定6次，分別記錄峰面積，計算得CA和CI峰面積的RSD分別為0.09%、1.36%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算得到CA和CI峰面積的RSD分別為0.52%、0.82%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 精密稱取長梗金腰藥材粉末約0.5 g，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，并根據標準曲線分別計算CA和CI含量。結果顯示，CA和CI含量的RSD分別為1.62%、1.04%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 分別取CA、CI適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，制成CA、CI質量濃度分別為1.60、0.90 mg/mL的混合對照品溶液。精密稱取適量已知含量的長梗金腰樣品約0.25 g，平行6份，加入混合對照品溶液1 mL（相當于藥材原有含量的100%）；按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。結果顯示，CA、CI的平均加樣回收率分別為95.96%、102.63%，RSD分別為1.88%、2.98%（n＝6），表明該方法準確性良好。

2.2 長梗金腰中CA和CI的提取工藝優化

2.2.1 長梗金腰提取物的制備及CA和CI的總轉移率測定 稱取長梗金腰藥材粉末1.0 g（過三號篩），置于150 mL具塞錐形瓶中，分別加入相應體積分數的乙醇溶液，密塞，靜置12 h；于相應溫度下超聲（頻率40 kHz，功率250 W，下同）提取45 min，過濾，濾液于40 ℃條件下減壓回收乙醇，得浸膏狀提取物。將所得浸膏狀提取物置于－20 ℃條件下冷凍2 h，再置于冷凍真空干燥機中干燥，即得固態提取物。取固態提取物約0.1 g，精密稱定，置于50 mL燒杯中，精密加入10 mL甲醇，超聲使其充分溶解；取上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，根據標準曲線計算CA和CI的含量，再計算CA和CI的轉移率（轉移率＝固態提取物中目標成分含量×提取物得率/生藥材中目標成分含量×100%）。

2.2.2 正交實驗 采用L9（34）正交實驗對長梗金腰中CA和CI的提取工藝進行優化。以乙醇體積分數（A）、浸提溫度（B）、浸提次數（C）及料液比（D）為考察因素，以CA和CI的總轉移率為評價指標，根據L9（34）正交表設計實驗，然后按“2.2.1”項下方法進行提取，計算CA和CI的總轉移率。正交實驗的因素與水平見表2，正交實驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 正交實驗的因素與水平

表3 正交實驗設計及結果

表4 方差分析結果

由表4可知，影響長梗金腰中CA和CI的總轉移率的顯著程度依次為A＞D＞B＞C，即乙醇體積分數＞料液比＞浸提溫度＞浸提次數。其中，因素A對CA和CI的提取有顯著影響（P＜0.01），但其A2（50%乙醇）與A3（90%乙醇）水平的K值非常接近，從提取成本的角度考慮，本研究選擇50%乙醇為提取溶劑。因素B、C、D對CA和CI的提取無顯著影響，綜合降低能耗、簡化提取程序、節約溶劑的考慮分別選擇室溫、提取1次及料液比1∶8作為提取參數。因此，最終確定最優提取工藝為A2B1C1D1，即將長梗金腰藥材粉末以8倍量的50%乙醇在室溫下一次性超聲提取45 min。

2.2.3 最優提取工藝的驗證 按照“2.2.2”項下最優提取工藝條件提取長梗金腰中的CA和CI，平行3次。結果顯示，長梗金腰中CA和CI的平均總轉移率為95.43%，RSD為1.02%（n＝3）；平均總含量為25.55 mg/g，RSD為1.13%（n＝3）。這表明該工藝合理、穩定、可行。

2.3 長梗金腰中CA和CI的富集工藝優化

筆者前期預實驗考察了HP?20、HPD?500、D101型號大孔吸附樹脂對長梗金腰中CA和CI總飽和吸附和洗脫的影響，結果發現，3種大孔吸附樹脂對CA和CI的吸附效果均較好；但在洗脫過程中，相較于HP?20、HPD?500型大孔吸附樹脂，D101型大孔吸附樹脂吸附的CA和CI更易洗脫。因此，本研究筆者采用D101型大孔吸附樹脂來富集長梗金腰中的CA和CI。由于柱層析過程中洗脫參數對CA和CI的富集具有重要的影響，因此筆者考察了雜質和目標成分的洗脫劑體積分數及用量對長梗金腰中CA和CI富集工藝的影響。

2.3.1 長梗金腰提取物的制備 取300.0 g長梗金腰按“2.2.2”項下的最優提取工藝提取長梗金腰中的CA和CI，得固態提取物，于4 ℃條件下保存備用。

2.3.2 上柱樣品溶液的制備 取1.0 g長梗金腰固態提取物置于50 mL燒杯中，加入20倍量蒸餾水，攪拌均勻，超聲處理10 min，過濾，即得質量濃度為50.0 mg/mL的樣品溶液（以提取物計）。

2.3.3 洗脫劑體積分數的考察 稱取1份處理好的D101型大孔吸附樹脂66.0 g，濕法裝柱，裝入3 cm×35 cm的層析柱中[1柱床體積（BV）＝75 mL]。將100 mL的樣品溶液以2 BV/h的流速上柱，靜置1 h，再依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇各洗脫4 BV，分別收集各段洗脫流分，采用HPLC法測定各樣品洗脫流分中CA和CI的含量，并記錄色譜圖。結果如圖 2所示，當乙醇體積分數＜50%時，洗脫流分中CA和CI的總量（以mg計，下同）隨著乙醇體積分數的升高而增大，且10%、20%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量甚微；當乙醇體積分數＞50%時，洗脫流分中CA和CI的總量呈下降趨勢，且80%、90%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量甚微。由此可知，50%乙醇可最大限度地將CA和CI解吸完全，故確定50%乙醇為CA和CI洗脫劑。20%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量小，可將大部分極性較大的雜質洗脫下來，故確定20%乙醇為雜質洗脫劑。

圖2 洗脫劑體積分數對CA和CI解吸附效果的影響

2.3.4 雜質洗脫劑用量的考察 稱取3份D101型大孔吸附樹脂，每份66.0 g，濕法裝柱，分別裝入3 cm×35 cm的層析柱中。將100 mL樣品溶液以2 BV/h流速上柱，靜置1 h，分別以2、4、6 BV 20%乙醇洗脫雜質（流速為2 BV/h），然后用4 BV 50%乙醇以2 BV/h流速洗脫CA和CI，收集洗脫流分；采用HPLC法測定各樣品洗脫流分中的CA和CI的含量，并記錄色譜圖。結果如圖3所示，經2、4、6 BV 20%乙醇洗脫雜質后，進一步收集的4 BV 50%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量分別為1.45、3.60、3.16 mg。由此可知，4 BV 20%乙醇洗脫雜質的效果較好。

圖3 雜質洗脫劑用量對雜質洗脫效果的影響

2.3.5 CA和CI洗脫劑用量的考察 稱取1份D101型大孔吸附樹脂66.0 g，濕法裝柱，分別裝入3 cm×35 cm的層析柱中。將100 mL樣品溶液以2 BV/h流速上柱，靜置1 h；用4 BV 20%乙醇沖洗雜質后，再用6 BV 50%的乙醇進行洗脫，每隔1 BV就收集一份洗脫流分；采用HPLC法測定各樣品洗脫流分中CA和CI的含量，并記錄色譜圖。結果如圖 4所示，第2 BV時50%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量已達到最大值，第4 BV時50%乙醇洗脫流分中CA和CI的總量很低，說明到第4 BV時已基本洗脫完全。因此，確定4 BV為50%乙醇洗脫劑的最佳用量。

圖4 目標產物洗脫劑用量對CA和CI洗脫效果的影響

2.3.6 最優富集工藝的驗證 取已標定CA和CI總含量為27.8 mg/g的樣品適量，按“2.3.2”項下方法制備上柱樣品溶液，分成3份，每份100 mL，分別加入到3份裝有D101型大孔吸附樹脂的層析柱中，上樣流速為2 BV/h，靜置1 h；采用上述優化的富集參數進行層析操作，采用HPLC法測定各樣品洗脫流分中CA和CI的含量，并計算富集倍數。結果顯示，經D101型大孔吸附樹脂富集后的提取物中CA和CI的平均總含量為322.7 mg/g，RSD為1.05%（n＝3），平均富集倍數為11.61倍，這表明該最優富集工藝的富集效果顯著，工藝重復性好。

3 討論

黃酮類化合物在植物體內分布極其廣泛，是許多中草藥的有效成分。在植物黃酮類成分的提取方法中，傳統的回流提取法設備簡單，但提取溫度高且提取時間較長，容易造成黃酮類成分的氧化損失；超聲提取法與回流提取法相比，能極大縮短提取時間，減少溶劑使用和降低能耗[5―6]。筆者在前期研究中，考察了超聲提取法和傳統回流提取法對長梗金腰中CA和CI的提取效果，結果發現，超聲提取法的提取率較高，且提取時間明顯短于回流提取法。筆者進一步對超聲提取法的工藝參數乙醇體積分數（0、25%、50%、75%、95%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30，g/mL）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時間（30、45、60 min）進行了單因素實驗。結果發現，超聲提取時間在45 min以上對CA和CI的提取率沒有明顯影響。因此，筆者在單因素實驗的基礎上，進行了4因素3水平的正交實驗，以進一步優化長梗金腰中CA和CI的超聲提取工藝。結果顯示，長梗金腰中CA和CI的最優提取工藝為8倍量的50%乙醇在室溫下一次性超聲提取45 min。經驗證，在該最優提取工藝條件下，CA和CI的轉移率可達到95.43%。

大孔吸附樹脂是一類人工合成的具有大孔結構的有機高分子共聚體，因其物理化學穩定性高、吸附容量大、選擇性好、使用周期長等優點而被廣泛應用于天然產物的富集分離[7―9]。采用大孔吸附樹脂柱層析工藝富集中藥有效成分的關鍵環節包括樹脂類型的篩選、飽和吸附量的確定、雜質洗脫劑考察及其洗脫體積的確定、目標成分洗脫劑考察及洗脫體積確定。前期研究中，筆者通過靜態吸附和動態洗脫實驗，優選了D101型大孔吸附樹脂作為富集長梗金腰中CA和CI的樹脂類型。在此基礎上，本研究優化得CA和CI的最優富集工藝：將上柱溶液加入D101型大孔吸附樹脂柱，靜置1 h；用4 BV 20%乙醇洗脫雜質，再用4 BV 50%乙醇洗脫CA和CI。進一步驗證，該富集工藝所得CA和CI的總含量為322.7 mg/g，樹脂富集倍數為11.61倍。

綜上所述，本研究成功優化了長梗金腰中CA和CI的提取富集工藝，可為CA和CI的藥物開發利用提供參考。