不同煎煮時間桑白皮湯煮散與湯劑的特征圖譜及多指標成分含量比較 Δ

蔣近近 ，吳磊 朱育鳳 孫思 邱明鳴 陸超 （.南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院藥學部，南京 20029；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 20029）

桑白皮湯源自明代張景岳所著的《景岳全書》，書中記載“治肺氣有余，火炎痰盛作喘”[1]，現收載于《古代經典名方目錄（第一批）》。桑白皮湯全方由桑白皮、黃芩、黃連、浙貝母、炒梔子、法半夏、炒紫蘇子、苦杏仁組成，具有清熱化痰、降肺平喘的功效，主治痰熱郁肺之喘證，在治療慢性阻塞性肺疾病、支氣管炎和哮喘等疾病方面臨床療效確切[2]。

目前，針對桑白皮湯的研究主要集中于臨床療效和作用機制方面[3]，而有利于新藥制劑研發的物質基準涉及甚少。國家藥品監督管理局發布的《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定》明確了“經典名方物質基準”研制為經典名方制劑申報和研制的必經階段[4]，但目前對于物質基準的制備并沒有統一的標準，因此針對具體的經典名方物質基準還需具體研究。鑒于此，本研究依據《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》以及《醫療機構中藥煎藥室管理規范》制備桑白皮湯煮散和湯劑2種物質基準[5―6]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立上述2種物質基準的特征圖譜和含量測定方法，比較二者煎煮過程中桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素6種指標成分含量的變化趨勢，為桑白皮湯的制劑開發提供實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1260型HPLC儀（美國Agilent公司，配置二極管陣列檢測器），GL224型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司），KQ?1000型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XH?C型旋渦混合器（金壇區西城新瑞儀器廠）。

1.2 主要藥品與試劑

桑白皮（產地安徽，批號22020831A）飲片購自揚子江藥業集團江蘇龍鳳堂中藥有限公司，法半夏（產地甘肅，批號D2022011）、黃芩（產地甘肅，批號202201）、苦杏仁（產地河北，批號202201?1）飲片均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，浙貝母（產地浙江，批號202201）、炒梔子（產地江西，批號202201）、炒紫蘇子（產地安徽，批號22020731A）、黃連（產地重慶，批號20220101?01）飲片均購自馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，上述飲片經江蘇省中醫院藥學部副主任中藥師吳磊鑒定均為真品；黃芩苷對照品（批號JZ21042102，純度≥98%）購自南京景竹生物科技有限公司；桑皮苷A、小檗堿、木犀草素、槲皮素、梔子苷對照品（批號分別為210717、210514、210711、210706、211008，純度均不低于98%）均購自南京聚康醫藥化工有限公司；甲醇、磷酸均為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 不同煎煮時間桑白皮湯煮散供試品溶液的制備 參考文獻[7―8]方法并進行優化后制備。稱取處方量飲片（桑白皮、法半夏、黃芩、苦杏仁、浙貝母、炒梔子、炒紫蘇子、黃連各3 g）共6份，分別搗成顆粒（過4目篩不過10目篩），置于陶瓷藥罐中，加水400 mL，浸泡60 min后取樣1 mL（記為T1），武火沸騰后取樣1 mL（記為T2），調節電陶爐功率至文火保持微沸，分別于煮沸5、10、15、20 min時取樣各1 mL（記為T3～T6）。將T1～T6樣品分別用甲醇定容至5 mL容量瓶中，渦旋混勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液，即得。

2.1.2 不同煎煮時間桑白皮湯湯劑供試品溶液的制備 參考文獻[7―8]方法并進行優化后制備。稱取處方量飲片（桑白皮、法半夏、黃芩、苦杏仁、浙貝母、炒梔子、炒紫蘇子、黃連各3 g）共11份，分別置于陶瓷藥罐中，加水350 mL，浸泡60 min后取樣1 mL（記為S1），武火沸騰后取樣1 mL（記為S2），調節電陶爐功率至文火保持微沸，分別于頭煎煮沸5、10、15、20、25、30 min時取樣各1 mL（記為S3～S8）；過濾，濾渣加水300 mL再次煎煮，分別于二煎煮沸5、10、20 min 后過濾，濾液與各頭煎液合并，混勻后取樣各1 mL（記為S9～S11）。將S1～S11樣品分別用甲醇定容至5 mL容量瓶中，渦旋混勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素對照品適量，置于不同具塞錐形瓶中，分別加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，密塞，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理10 min，放置至室溫，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，制備成質量濃度分別為506.00、1 089.00、499.00、1 010.00、522.00、510.00 μg/mL的單個對照品溶液。精密吸取單個對照品溶液各1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，用0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液，即得混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

采用Supersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇（A）?0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，5%A→20%A；10～50 min，20%A→30%A；50～85 min，30%A→40%A；85～120 min，40%A→50%A；120～140 min，50%A→60%A；140～150 min，60%A→90%A；150～155 min，90%A→95%A；155～160 min，95%A→5%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

2.3 桑白皮湯物質基準特征圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液（S8），按 “2.2” 項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以黃芩苷為參照峰，計算得各共有峰相對峰面積的RSD＜3.36%、相對保留時間的RSD＜1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（S8），室溫放置0、4、8、16、20、24 h后，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以黃芩苷為參照峰，計算得各共有峰相對峰面積的RSD＜3.82%、相對保留時間的RSD＜1.27%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液（S8），分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以黃芩苷為參照峰，計算得各共有峰相對峰面積的RSD＜4.24%、相對保留時間的RSD＜1.53%（n＝6），表明該方法重復性好。

2.3.4 特征圖譜的建立及相似度評價 取不同煎煮時間的桑白皮湯煮散與湯劑樣品（T1～T6和S1～S11），分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件進行分析，分別選取樣品T6、S8的圖譜為參照圖譜，時間寬度設定為0.1 min，采用中位數法，經多點校正，以Mark峰匹配得到桑白皮湯2種物質基準的特征圖譜（圖1、圖2），系統分別生成對照指紋圖譜R?T、R?S及相似度結果。結果顯示，在桑白皮湯煮散樣品T1～T6中共確定了21個共有峰，相似度分別為0.943、0.986、0.991、0.999、0.997、1.000；在桑白皮湯湯劑樣品S1～S11中共確定了18個共有峰，相似度分別為0.983、0.984、0.982、0.975、0.996、0.994、0.996、0.994、0.998、0.998、0.994。

圖1 桑白皮湯煮散物質基準的特征圖譜與對照指紋圖譜R?T

圖2 桑白皮湯湯劑物質基準的特征圖譜與對照指紋圖譜R?S

2.3.5 共有峰的指認 取“2.1.3”項下混合對照品溶液，稀釋32倍，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并與“2.3.4”項下對照指紋圖譜R?T、R?S比對進行色譜峰的指認，結果見圖3。結果，指認出桑白皮湯煮散物質基準特征圖譜中2、5、13、16、17、19號峰和湯劑物質基準特征圖譜中2、5、12、14、15、17號峰分別為桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素。

圖3 混合對照品色譜圖和2種基準物質對照指紋圖譜的疊加圖

2.4 桑白皮湯物質基準的含量測定

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.3”項下單個對照品溶液各適量，分別稀釋2、4、8、32、64倍作為線性工作液。精密吸取上述線性工作液和單個對照品溶液各5 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以被測成分的峰面積為縱坐標（Y）、進樣質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到各指標成分的回歸方程以及線性范圍（表1）。結果顯示，各待測成分在其質量濃度范圍內線性關系均良好（r均大于0.999 0）。

表1 各指標成分的回歸方程、線性范圍和相關系數

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.15%、1.11%、1.17%、0.72%、1.76%、1.44%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（S8），分別在室溫放置0、4、8、16、20、24 h，然后按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.69%、0.16%、0.81%、1.21%、0.60%、0.91%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法平行制成6份供試品溶液（S8），然后按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算各成分的含量。結果顯示，桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素含量的RSD分別為1.39%、0.31%、0.50%、0.92%、0.48%、0.73%（n＝6），表明該方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品（S8）1 mL，共6份，分別按已知成分含量1∶1的質量比加入“2.1.3”項下的單個對照品溶液（桑皮苷A對照品溶液80 μL、梔子苷對照品溶液540 μL、小檗堿對照品溶液290 μL、黃芩苷對照品溶液270 μL、槲皮素對照品溶液45 μL、木犀草素對照品溶液70 μL），混勻，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算各成分的含量，并計其加樣回收率。結果顯示，桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素的平均加樣回收率分別為95.96%、96.32%、99.12%、98.48%、93.75%、96.99%，RSD分別為1.57%、1.97%、1.28%、0.44%、2.01%、1.74%（n＝6），表明該方法的準確度較好。

2.4.6 含量測定 取“2.1.1”“2.1.2”項下樣品T1～T6、S1～S11的供試品溶液，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算6種指標成分的含量。實驗平行3次，取平均值，結果見表2。

表2 桑白皮湯物質基準的含量測定結果（n＝3，μg/mL）

3 討論

3.1 桑白皮湯物質基準的制備

在經典名方的新藥研發中，物質基準的研制是保障其質量的關鍵環節，與藥物的安全性和有效性密切相關。根據《中國科學技術史：度量衡卷》中的單位量值“1分為0.373 g”[9]，方中8味藥，折算劑量為每味藥各3 g，處方總量為24 g。依據劉默等[10]對桑白皮湯的成方考證 “水二盅，姜三片，煎八分，溫服”，其制法為“粗搗篩，一劑一煎一服，加水量為400 mL煎至320 mL”。參考仝小林等[11]將飲片搗成粗粉顆粒（過4目篩不過10目篩）煎煮1次制備煮散，主要有效成分的溶出在10～20 min達到平衡；將飲片直接入藥煎煮2次制備湯劑時，加水量一般為藥材質量的12～20倍，主要有效成分的溶出在50～60 min達到平衡。因此，本研究桑白皮湯煮散的制備工藝確定為：煎煮1次，時間為20 min，加水量為400 mL；湯劑的制備工藝確定為：煎煮2次，時間分別為30、20 min，加水量分別為350、300 mL。由于本方中質地堅硬的藥材較多，浸泡時間理應不少于30 min，為完全浸透藥材，本研究最終將浸泡時間定為60 min。此外，基于臨床應用一致性原則，本研究統一選用2 100 mL的陶瓷藥罐作為單劑處方的煎煮容器，先武火（功率1 700 W）煮沸再文火（功率300 W）繼續加熱保持微沸。

3.2 定量分析指標成分的選擇

《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定》第十五條明確指出：經典名方制劑藥品標準的制定要加強多成分、整體質量控制[4]。目前，關于經典名方桑白皮湯指標成分的研究，僅有桑皮苷A的報道[12]，有必要進行重新定位。

筆者通過查閱資料[12―14]，篩選出槲皮素、木犀草素、桑皮苷A、小檗堿、黃芩苷和梔子苷6種主要指標成分。桑白皮湯方中桑白皮為君藥，可瀉肺火、祛痰平喘，筆者選取其中具有鎮痛抗炎、抗氧化的成分桑皮苷A作為指標成分；黃芩可瀉肺火、消痰熱，浙貝母可清熱、化痰、降氣，炒梔子、黃連可清肺熱、瀉肺火，四者共為臣藥，筆者選取其中具有抗炎、抑菌作用的成分黃芩苷、梔子苷、小檗堿作為指標成分；法半夏可燥濕、化痰、止咳，炒紫蘇子可降氣、化痰、平喘，苦杏仁可降氣、止咳、平喘，三者共為佐藥，筆者選取炒紫蘇子中具有抗炎、鎮咳、祛痰作用的成分木犀草素作為指標成分。此外，筆者還選取桑白皮、梔子、黃連的共有成分槲皮素作為指標成分，兼顧了方中君臣佐使藥。

3.3 色譜條件的選擇

在前期研究中，筆者比較了在238、254、280和345 nm這4個波長下樣品的出峰情況，結果在254 nm波長下樣品的出峰數目較多、分離度較高，故本研究最終選擇測定波長為254 nm。此外，本研究還比較了甲醇?水、乙腈?水、甲醇?磷酸水溶液作為流動相的出峰情況，優選出甲醇?磷酸水溶液作為流動相體系，并在此基礎上又考察了不同體積分數的磷酸水溶液（甲醇?0.05%磷酸水溶液和甲醇?0.1%磷酸水溶液）對分離效果的影響。結果顯示，以甲醇?0.1%磷酸水溶液為流動相時，所測各成分峰形和分離效果均較好，且基線平穩、無拖尾現象，故本研究最終選用甲醇?0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.4 含量測定結果分析

本研究結果顯示，同等質量桑白皮湯煮散和湯劑在煎煮過程中桑皮苷A、梔子苷、小檗堿、黃芩苷、槲皮素、木犀草素的含量隨著煎煮時間的延長基本呈上升趨勢。相比于煮散，湯劑在煎煮過程中指標成分的溶出速度較慢，且共有峰也較少；煎煮5 min之前，2種物質基準指標成分含量相差不大；但煎煮5 min之后，煮散中指標成分含量快速上升，湯劑中指標成分含量則緩慢上升；煮散煎煮20 min時，指標成分含量為湯劑煎煮50 min時的1.1～1.5倍，總含量為湯劑的1.2倍。單從總含量來看，煮散煎煮10 min時指標成分含量與湯劑煎煮40 min相當。在煎煮15～20 min時，煮散中指標成分黃芩苷的含量有減少趨勢。這可能是隨著煎煮時間的延長，水量因蒸發逐漸減少所致；或者是因為溶液的吸附作用逐漸強于擴散作用，指標成分溶出量減少所致[7]。總體來看，桑白皮湯煮散比湯劑更具縮短煎煮時間、節約中藥資源的優勢，在后續桑白皮湯制劑的開發中更具有研究價值。

綜上所述，本研究采用的HPLC分析方法穩定可行、準確度高、重復性好，所建立的特征圖譜系統地反映了桑白皮湯物質基準的特征性和化學信息。對2種物質基準煎煮過程中的6種指標成分和總含量進行測定和比較，可為后續桑白皮湯制劑的開發中提供“遵古”依據，并奠定實驗基礎。但桑白皮湯臨床上用煮散代替湯劑使用時，如何調整用量從而保證其生物等效性和安全性，還需要進一步研究。