菟絲子總黃酮中擬雌激素作用的活性成分篩選 Δ

岳 霞，宋 輝，徐 媛，劉迪施，孫向明 ，李文蘭（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子，其用藥歷史悠久，為補益類常用中藥[1]，具有補腎益精、安胎明目等多種功效[2]。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)菟絲子在激素調(diào)節(jié)[3]、保肝明目[4]、保護(hù)心腦血管[5]、抗癌[6]和抗衰老[7]等方面表現(xiàn)出一定的藥理療效。菟絲子植物分布廣泛，主要分布于黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、山東等地，學(xué)者們從菟絲子中已提取出多類化學(xué)成分，如黃酮類、生物堿類、木質(zhì)素類、有機酸類和其他成分等[8―9]。

當(dāng)婦女進(jìn)入更年期后，各類雌激素指標(biāo)驟然下降，從而出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)、煩悶易怒、入睡困難等更年期癥狀，雌激素替代療法可以使更年期癥狀得到明顯改善；但長期使用人工合成的雌激素易對身體造成極大的損傷，如心腦血管損傷、腎臟損傷以及其他疾病等[10]。為此，科學(xué)家們不斷尋求更為安全、有效的雌激素替代物。目前，國內(nèi)外已有多種關(guān)于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和其他輔助藥的報道，其中尤為重要的一類藥物就是植物雌激素[11―12]，其被認(rèn)為是一種更安全、更有前途的雌激素替代品。

本課題組前期研究表明，菟絲子醇提物有顯著的擬雌激素活性，且其擬雌激素活性成分多為黃酮類[13]。本研究首先對菟絲子總黃酮的擬雌激素作用進(jìn)行驗證，建立10批菟絲子總黃酮的指紋圖譜；然后以小鼠子宮系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度為指標(biāo)對共有峰進(jìn)行活性檢識，再采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC?Q?TOF?MS）技術(shù)對菟絲子總黃酮成分進(jìn)行表征，明確菟絲子總黃酮中擬雌激素作用的活性成分，以期為植物雌激素類藥物的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LE2O4E/O2型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Acquity型超高效液相色譜（UPLC）儀、PGA495型質(zhì)譜儀（美國Waters公司），CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），YN?02B1型生物組織包埋機（深圳市永年科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

綠原酸、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮苷、芹菜素對照品（批號分別為 20160312、20130621、20151225、20160615、20150813、20170224，純度≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；金絲桃苷對照品（純度≥98%，批號111521?201903）購自上海金穗生物有限公司；戊酸雌二醇（陽性對照藥，批號20191038）購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；蘇木素染液、伊紅染液（批號分別為20190504、20190103）購自北京索萊寶生物科技公司。菟絲子藥材（編號S1～S10）購自不同的菟絲子種植基地，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院曲中原教授鑒定為旋花科植物南方菟絲子C.australisR.Br.或菟絲子C.chinensisLam.的干燥成熟種子，其藥材產(chǎn)地信息見表1。

表1 菟絲子藥材產(chǎn)地信息

1.3 動物

本研究所用動物為雌性未成年ICR小鼠，體質(zhì)量為（10±2） g，購自長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（吉）?2020?0002。本實驗經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為HSDYXY?2020005。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 陽性對照藥混懸液的制備 取戊酸雌二醇適量，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的混懸液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別稱取10個不同產(chǎn)地菟絲子藥材適量，粉碎過篩，按文獻(xiàn)[13]方法制備總黃酮浸膏（以蘆丁計，總黃酮的純度為29.84%～31.68%）。取菟絲子總黃酮浸膏1 g，用80%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，從中取1 mL溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，以80%甲醇定容，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.1.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、金絲桃苷、山柰酚、槲皮素、槲皮苷、異鼠李素、芹菜素對照品適量，以80%甲醇溶解，并定容于10 mL容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，即得混合對照品溶液。

2.2 菟絲子總黃酮擬雌激素作用考察

2.2.1 分組與給藥 將小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組（戊酸雌二醇，0.075 mg/kg，劑量根據(jù)本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）和不同產(chǎn)地（S1～S10）菟絲子總黃酮組（8 g/kg，以菟絲子生藥量計，劑量根據(jù)本課題組預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置），每組10只。給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組灌胃等體積蒸餾水，每天早晚各給藥1次，連續(xù)4 d。

2.2.2 小鼠子宮系數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度的檢測 末次給藥1 h后，將各組小鼠脫頸處死，剖取子宮，稱定質(zhì)量，并計算子宮系數(shù)（子宮系數(shù)＝子宮質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。將子宮置于10%甲醛溶液中固定1～2 d，再進(jìn)行組織包埋、切片、染色、脫水、膠封，采用顯微鏡觀察小鼠子宮特征變化，并測量子宮內(nèi)膜厚度。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，陽性對照組和S1～S10菟絲子總黃酮組小鼠子宮系數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度（S3、S7菟絲子總黃酮組除外）均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。空白對照組子宮內(nèi)膜上皮、間質(zhì)、腺體無增生，肌層排列緊密，子宮內(nèi)膜壁薄，無明顯增厚及突出。陽性對照組和S1～S10菟絲子總黃酮組小鼠子宮內(nèi)膜增厚明顯，內(nèi)膜上皮由低柱狀形態(tài)進(jìn)展為高柱狀形態(tài)，內(nèi)膜間質(zhì)疏松。結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 各組小鼠子宮系數(shù)的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

圖2 各組小鼠子宮內(nèi)膜厚度的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

圖3 各組小鼠子宮HE染色結(jié)果 （×200）

2.3 不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18R RHD（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；保護(hù)柱為ACQUITY UPLC R BEH C18；柱溫為 40 ℃；流速為 0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；流動相為0.1%甲酸溶液（A）?乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，10%B→19%B；2～5 min，19%B；5～6 min，19%B→44%B；6～14 min，44%B→60%B；14～19 min，60%B→95%B；19～20 min，95%B→100%B）。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，電壓為3.0 kV，溫度為100 ℃，去溶劑氣溫度為400 ℃，去溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。采用正負(fù)離子模型進(jìn)行掃描，掃描范圍為m/z50→1 200，碰撞能為20～45 mV。

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液適量，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，正離子模式選取13號峰（槲皮素）作為參照峰，負(fù)離子模式選取23號峰（槲皮素）作為參照峰，記錄各共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，兩種模式下各共有峰相對峰面積的RSD均小于3.0%，相對保留時間的RSD均小于2.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，正離子模式選取13號峰作為參照峰，負(fù)離子模式選取23號峰作為參照峰，記錄各共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，兩種模式下各共有峰相對峰面積的RSD均小于3.0%，相對保留時間的RSD均小于2.5%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液適量，于室溫放置0、3、6、8、12、24 h時按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，正離子模式選取13號峰作為參照峰，負(fù)離子模式選取23號峰作為參照峰，記錄各共有峰相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，兩種模式下各共有峰相對峰面積的RSD均小于3.0%，相對保留時間的 RSD均小于3.0%（n＝6），表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.6 指紋圖譜的建立 取“2.1.2”項下供試品溶液適量，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》對10批不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的指紋圖譜進(jìn)行分析，生成正負(fù)離子模式下的對照指紋圖譜（R）和疊加指紋圖譜。如圖4所示，正、負(fù)離子模式下分別標(biāo)出28、33個共有峰。

圖4 正負(fù)離子模式下不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的疊加指紋圖譜及對照圖譜（R）

2.4 不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的譜?效相關(guān)性分析

2.4.1 雙變量相關(guān)性分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，將10批不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的共有峰相對峰面積進(jìn)行均值化處理后，以小鼠子宮系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度為變量，進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，并計算Pearson相關(guān)系數(shù)，其絕對值越大表明相關(guān)性越好。結(jié)果顯示，在正離子模式下，有10個共有峰與菟絲子總黃酮的擬雌激素作用相關(guān)（P＜0.05），分別是7、10、12～16、18、22、26號峰。在負(fù)離子模式下，有14個共有峰與菟絲子總黃酮的擬雌激素作用有關(guān)（P＜0.05），分別是2、5、8、9、12、16、19、22～28號峰。

2.4.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 采用DPS軟件進(jìn)行分析，將10批不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的共有峰相對峰面積進(jìn)行均值化處理后，以此為子序列，再以小鼠子宮系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度為母序列，可得到子序列與相應(yīng)母序列的關(guān)聯(lián)度，將其按從大到小的順序排列級組成關(guān)聯(lián)序，通過關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果，判斷各子序列對母序列的“貢獻(xiàn)”程度。通常認(rèn)為關(guān)聯(lián)度＞0.5即存在關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)度越大關(guān)聯(lián)性越好[14―15]。本研究選擇關(guān)聯(lián)度大于0.6的成分作為高度相關(guān)的成分。結(jié)果顯示，正離子模式下，有19個共有峰的關(guān)聯(lián)性較強，分別是3、5、7～17、19、20、24～26、28號峰。負(fù)離子模式下，有21個共有峰的關(guān)聯(lián)性較強，分別是2、5、7～9、11～17、19～26、31號峰。

2.4.3 綜合分析 將“2.4.1”“2.4.2”項下正負(fù)離子模式下的結(jié)果取交集發(fā)現(xiàn)，正離子模式下的7、10、12～16、26號峰及負(fù)離子模式下2、5、8、9、12、16、19、22～26號峰所代表的成分與菟絲子總黃酮的擬雌激素作用高度相關(guān)。

2.5 菟絲子總黃酮成分的表征

由于樣本S9在正、負(fù)離子模式下所呈現(xiàn)的化學(xué)成分均較為全面，因此取S9樣品的供試品溶液和“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，即得菟絲子總黃酮供試品溶液及混合對照品的總離子流圖（圖5）。采用Waters Masslynx V 4.1軟件對正、負(fù)離子模式下的總離子流圖進(jìn)行處理，獲取各共有峰的保留時間及一、二級質(zhì)譜信息，根據(jù)精確的準(zhǔn)分子離子峰的m/z初步判斷化合物的相對分子質(zhì)量、元素組成和分子式，并與對照品及自建數(shù)據(jù)庫中各化學(xué)成分的信息進(jìn)行比對，同時參考各類化合物的裂解規(guī)律[16―20]，根據(jù)碎片離子信息推測化合物。結(jié)果見表2。

圖5 菟絲子總黃酮供試品溶液及混合對照品的總離子流圖

表2 菟絲子總黃酮中各色譜峰的化學(xué)成分分析結(jié)果

由表2可知，菟絲子總黃酮中共有16個擬雌激素活性成分，分別為5，7，3′，4′?四甲氧基黃酮、6?O?（反式）對香豆酰基?呋喃果糖?（2→1）?吡喃葡萄糖苷、蘆丁、山柰酚?3，7?雙葡萄糖苷、芹菜素?7?O?葡萄糖苷、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素、杜鵑黃素、異槲皮苷、山柰酚?3?呋喃阿拉伯糖苷、2，6?十八碳二炔酸。

3 討論

目前，可利用乳腺癌細(xì)胞增殖率、動物血清中雌激素含量、雌激素受體的蛋白和mRNA表達(dá)水平、子宮系數(shù)、子宮內(nèi)膜厚等指標(biāo)來評價擬雌激素作用[21―22]。結(jié)合本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用小鼠子宮系數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度這2個指標(biāo)進(jìn)行評價，可更好地反映雌激素樣效果。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的擬雌激素活性均較好。進(jìn)一步在正負(fù)離子模式下建立不同產(chǎn)地菟絲子總黃酮的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)在正、負(fù)離子模式下共有28、33個共有峰。結(jié)合雙變量相關(guān)性分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，正離子模式下的7、10、12～16、26號峰及負(fù)離子模式下2、5、8、9、12、16、19、22～26號峰所代表的成分與菟絲子總黃酮的擬雌激素作用高度相關(guān)。經(jīng)化學(xué)成分鑒定發(fā)現(xiàn)，這16個成分分別為5，7，3′，4′?四甲氧基黃酮、6?O?（反式）對香豆酰基?呋喃果糖?（2→1）?吡喃葡萄糖苷、蘆丁、山柰酚?3，7?雙葡萄糖苷、芹菜素?7?O?葡萄糖苷、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素、杜鵑黃素、異槲皮苷、山柰酚?3?呋喃阿拉伯糖苷、2，6?十八碳二炔酸。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠提高雌性青春期大鼠雌二醇、孕酮水平，促進(jìn)催乳素、生長激素分泌，上調(diào)乳腺組織中雌激素受體、孕激素受體、催乳素受體和生長激素受體的表達(dá)量，促進(jìn)乳腺發(fā)育[23]。也有研究表明，槲皮素在雌激素相關(guān)疾病中的作用機制呈多元化，主要包括抗氧化作用，調(diào)控雌激素代謝，調(diào)節(jié)雌激素受體及其下游信號通路等[24]。

綜上所述，本研究從菟絲子總黃酮中篩選出16種擬雌激素作用的化學(xué)成分，可為植物雌激素類藥物的開發(fā)提供參考。