馬里苷對db/db小鼠腎臟組織內皮-間質轉化和纖維化的改善作用及機制

張芳，郭瓊，田亞婷，張博翔，李甜

1 新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830011；2 新疆醫科大學第二臨床醫學院

糖尿病腎病（DN）是導致終末期腎病的主要原因，腎臟纖維化是糖尿病腎病的普遍病理特征，主要表現為細胞外基質的堆積［1］。研究證明，內皮-間質轉化（EndMT）或上皮-間質轉化（EMT）能夠促進器官纖維化發生發展，其特征為內皮標志物（CD31）的表達下降和間充質標志物［纖維連接蛋白（Fibronectin）、波形蛋白（Vimentin）］的表達上升［2］。馬里苷是一種黃酮類化合物，提取于功效獨特的稀有高寒、野生植物兩色金雞菊，能夠降血糖、調血脂，有抑制糖異生、改善糖尿病腎臟纖維化等功效，對延緩糖尿病腎病進程有潛在的價值［3-4］。然而馬里苷對糖尿病腎臟纖維化和EndMT 作用相關的分子機制還有待進一步研究。成纖維細胞生長因子受體Ⅰ（FGFR1）屬于受體酪氨酸激酶，其與配體成纖維細胞生長因子（FGF）結合后發揮生物學作用［5］。研究表明，FGFR1 可調節轉化生長因子β（TGF-β），在器官纖維化過程中發揮重要作用［6］。馬里苷與FGFR1 有較強的相互作用，推測FGFR1 與馬里苷改善糖尿病腎臟纖維化有關［7］。2022 年，本研究以糖尿病瘦素受體基因缺陷小鼠（db/db 小鼠）為研究對象，探究馬里苷對糖尿病db/db小鼠腎臟EndMT 和纖維化的改善作用及機制，為馬里苷相關藥物的研究與開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

1.1.1 實驗動物 選取6 周齡野生型瘦素受體基因缺陷雜合（db/m）正常雄性小鼠10只，體質量（16 ± 2）g；6 周齡自發性糖尿病db/db 雄性小鼠30 只，體質量（28 ± 2）g。小鼠均由江蘇常州卡文思實驗動物有限公司提供，生產許可號：SCXK（蘇）2016-0010。小鼠飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF級動物飼養室，單籠、單只飼養，自由飲水，每隔2 d 更換墊料。SPF動物飼養室模擬自然晝夜條件，日間相對溫度（20 ± 2）℃，相對濕度（45 ± 5）%，每日日照時間為12 h，24 h 保持通風狀態。飼養小鼠所使用的鼠籠、飼料、飲用水以及墊料均經過高溫高壓滅菌處理，按照國際動物保護相關指南和規定進行動物實驗。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器 馬里苷購自法國Extrasynthese 公司；二甲雙胍購自美國MCE 公司；Fibronectin、CD31 和FGFR1 基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔抗Fibronectin、Vimentin抗體購自abcam貿易有限公司；兔抗CD31、GAPDH 抗體購自美國Affinity 公司；兔抗FGFR1 購自美國CST 公司；兔抗TGF-β、二抗IgG H&L/HRP購自博奧森生物技術有限公司；RNA 提取、逆轉錄和熒光定量PCR 試劑盒購自福際生物技術有限公司；垂直電泳槽購自美國Bio-Rad 公司；Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6 and 7 Flex 實時定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；拍照顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 動物分組及藥物干預 取10 只db/m 小鼠作為正常對照組，按隨機數字表法將30 只db/db 小鼠分為糖尿病模型組10 只、二甲雙胍組10 只、馬里苷組10 只。二甲雙胍組給予二甲雙胍280 mg/kg 灌胃、馬里苷組給予50 mg/kg 馬里苷組灌胃，正常對照組、糖尿病模型組均給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 mL/10 g灌胃，每日1次，共持續8周。各組均喂養轉基因敲除小鼠飼料、基礎飼料，正常飲水。

1.3 空腹血糖水平檢測 第8 周末次給藥后24 h，固定小鼠，用乙醇棉球消毒鼠巴后剪去一截，待鼠尾形成足夠大的血珠時用血糖試紙吸取血珠，將血糖試紙插入羅氏血糖測量儀，記錄空腹血糖。

1.4 腎組織中EndMT 標志物（Fibronectin、Vimentin、CD31）、纖維化指標（TGF-β）、FGFR1 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。檢測空腹血糖后麻醉小鼠，用斷脊法將其處死后解剖，摘取雙側腎臟，用生理鹽水清洗，并用濾紙將組織表面水分吸干。摘除腎臟表層包膜，沿縱向將腎臟組織均分，分別放于1.5 mL凍存管和4%多聚甲醛中固定。取出凍存于-80 ℃的小鼠腎臟組織，在研磨管內加入裂解液，用組織研磨儀進行研磨，每組研磨4～5次，每次40 s。研磨完成后將組織放置于冰上充分裂解30 min。隨后將裂解產物離心12 000 r/min離心20 min（離心半徑72 mm），吸取上清液，測定蛋白濃度。測定后每4體積蛋白上清液加入1體積4×loading buffer（含β-巰基乙醇，1%），100 ℃沸水水浴10 min。蛋白變性后，加樣進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉PVDF 膜。將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉封閉，抗體孵育4 ℃過夜（1∶1 000的兔抗Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1、GAPDH）。第2天TBST洗膜，隨后加入酶標二抗（1∶5 000 的HRP 標記的山羊抗兔IgG）室溫避光孵育50 min，TBST 洗膜后進行ECL 顯色反應，曝光、顯影圖片存檔，采用Image J 軟件處理分析目的條帶的灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.5 腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。剪取腎組織樣品置于研磨管內，研磨充分后進行振蕩和離心，1 2 000 r/min離心20 min（離心半徑72 mm），把離心后的水相層轉移到新的離心管，根據試劑盒操作說明書，進行動物組織RNA 提取。測定RNA 濃度、純度。將RNA逆轉錄成cDNA，行RT-PCR。反應體系：SYBR GreenⅠ標記底物混合液10 μL、cDNA 模板0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、無酶水8 μL、ROX 0.4 μL，總體積20.4 μL。反應條件：預變性95 ℃ 5 min，循環中模板變性95 ℃ 10 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 20 s共45 個循環。用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。Fibronectin 上游引物5'-CTATAGGATTGGAGACACGTGG-3'，下 游 引 物5'-CTGAAGCACTTTGTAGAGCATG-3'；CD31 上游引物5'-CACAACAAACAAGCTAGCAAGA-3'，下 游 引 物5'-TTTGGCTGCAACTATTAAGGTG-3'；FGFR1 上游引物5'-AATGGATTCTGTGGTGCCTTCTGAC-3'，下游引物5'-GCTGGTAGGTGTGGTTGATGCTC-3'；GAPDH 上游 引 物5'-ACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'，下 游 引 物5'-AAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG-3'。

1.6 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用獨立樣本LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組空腹血糖水平比較 第8 周正常對照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、馬里苷組空腹血糖水平分 別為（6.38 ± 0.68）、（30.10 ± 2.49）、（26.12 ± 3.26）、（26.90 ± 1.58）mmol/L。與正常對照組比較，糖尿病模型組空腹血糖水平高（P＜0.05）；與糖尿病模型組比較，二甲雙胍組、馬里苷組空腹血糖水平低（P均＜0.05）；二甲雙胍組空腹血糖水平與馬里苷組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達比較 見表1。

表1 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達比較（±s）

表1 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，&P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病模型組二甲雙胍組馬里苷組n 6 6 6 6 Fibronectin蛋白1.00 ± 0.09 1.42 ± 0.14*0.97 ± 0.21#1.06 ± 0.16#Vimentin蛋白1.00 ± 0.12 2.08 ± 0.13*1.51 ± 0.26#1.19 ± 0.16#&CD31蛋白1.00 ± 0.06 0.79 ± 0.07*1.00 ± 0.18#0.94 ± 0.11#TGF-β蛋白1.00 ± 0.07 1.19 ± 0.12*0.96 ± 0.17#0.95 ± 0.15#FGFR1蛋白1.00 ± 0.08 2.34 ± 0.22*2.03 ± 0.38#1.69 ± 0.22#&

2.3 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達比較 見表2。

表2 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達比較（±s）

表2 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，&P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病模型組二甲雙胍組馬里苷組n 6 6 6 6 Fibronectin mRNA 1 2.62 ± 0.23*2.08 ± 0.10#1.74 ± 0.11#&CD31 mRNA 1 0.65 ± 0.03*0.84 ± 0.12#0.75 ± 0.01#&FGFR1 mRNA 1 1.92 ± 0.17*1.21 ± 0.06#1.32 ± 0.15#

3 討論

糖尿病并發癥嚴重影響患者的生活質量和預期壽命，給患者及社會帶來了極大的醫療和經濟負擔［8］。器官纖維化的防治一直是糖尿病研究領域的重要課題。腎臟纖維化常見于糖尿病晚期，表現為腎組織中細胞外基質的過度沉積，最終導致腎臟功能衰竭［9］。糖尿病的高血糖、高血脂和胰島素抵抗可通過觸發上皮細胞和內皮細胞向成纖維細胞樣表型轉化，或者直接刺激成纖維細胞合成基質［10］，激活纖維化反應，但其中涉及的分子、基因及具體機制目前尚不清楚。目前主要集中于高糖環境刺激，造成活性氧的產生和生長因子的級聯反應，誘導促炎因子和趨化因子聚集，產生糖基化終產物，最終上調纖維生成和基質細胞蛋白的表達［11］。馬里苷是一種黃酮類化合物，能夠抑制糖異生和改善胰島素抵抗，調節機體血糖血脂紊亂，對改善和延緩糖尿病腎病進程有著潛在的應用價值［12］。已有研究表明，馬里苷可有效保護糖尿病腎臟功能障礙以及腎小管和腎小球病變，但其對糖尿病腎臟纖維化的保護作用及相關分子機制還有待進一步研究［13］。 FGFR1 屬于酪氨酸激酶家族受體，在血管生成、受傷組織修復以及能量代謝調節等方面扮演著十分重要的角色［14］。FGF 配體通過與細胞表面的FGFR 酪氨酸激酶發出信號，這些酪氨酸激酶在哺乳動物中由四種不同的基因編碼。配體結合后誘導FGFR 二聚化，使細胞內受體激酶結構域相互接近和準確配位，從而使其發生磷酸化激活激酶。激活的受體激酶依次磷酸化和激活細胞內底物，主要是FGFR 底物2α（FRS2α）和磷脂酶Cγ1 （PLCγ1）。激活的FRS2α 通過RASMAPK 通路或PI3K-AKT 通路啟動下游信號通路，從而發揮調節作用［15］。目前FGFR1 在癌癥中的作用研究較多，EMT 或EndMT 是幫助癌細胞轉移的重要途徑。在小鼠前列腺中過表達FGFR1 可誘導前列腺上皮內瘤變，并且在該模型中，前列腺上皮內瘤變在1年內發展為移行性肉瘤樣癌，提示發生了EMT。在化學誘導激活FGFR1 乳腺癌模型中，成年小鼠乳腺上皮中FGFR1 的激活誘導了MAPK 和AKT 依賴的癌細胞擴增，并最終導致浸潤性乳腺病變，同樣說明FGFR1 激活了EMT 促進癌細胞的侵襲、擴增［16］。此外在糖尿病背景下FGFR1 的作用也有較多研究［17-18］。在研究二甲雙胍對糖尿病大鼠FGFR1表達的影響實驗中，提示通過影響FGFR1作用于AKT 通路可改善高糖誘導的胰腺及脂肪組織的功能損傷［19］。研究表明，腎臟FGF23 和FGF2 從內皮細胞、足細胞、系膜細胞、間充質細胞和成纖維細胞中分泌，與腎臟FGFR1 受體結合，可促進內皮細胞和管狀上皮細胞向間充質轉化，從而加速腎組織間質累積和纖維化病變［20］。以上說明FGFR1 在糖尿病腎臟間質轉化和纖維化病變中有關鍵作用，進一步探究其分子作用機制以及藥物是否通過影響FGFR1改善糖尿病腎臟間質轉化和纖維化有一定的研究價值。

本研究以糖尿病模型db/db 小鼠為研究對象，以二甲雙胍為陽性對照。由各組第8 周空腹血糖檢測結果看出，馬里苷可有效降低db/db 小鼠的空腹血糖水平，對糖代謝紊亂有改善作用。在蛋白和基因水平，與正常對照組相比，糖尿病模型db/db 小鼠腎臟間質表型指標Fibronectin、Vimentin和纖維化指標TGF-β表達明顯升高，內皮細胞標志物CD31表達明顯下降，說明糖尿病模型組小鼠腎臟發生了End-MT 和纖維化，二甲雙胍和馬里苷可明顯降低db/db小 鼠Fibronectin、Vimentin、TGF-β 的 表 達，上 調CD31表達，說明馬里苷對db/db小鼠腎臟EndMT 和纖維化有一定的保護作用。此外，糖尿病db/db 小鼠腎組織FGFR1 分子表達上調，二甲雙胍和馬里苷給藥后可降低FGFR1 的表達，說明馬里苷可能通過降低FGFR1 的表達改善糖尿病腎臟EndMT 和纖維化。

綜上所述，馬里苷可改善糖尿病db/db 小鼠的腎臟EndMT 和纖維化，下調腎組織中FGFR1 表達。馬里苷可能通過下調FGFR1發揮對糖尿病db/db小鼠的腎臟EndMT 和纖維化的治療作用，但其中的通路還有待進一步研究。