生物鐘基因Per2對Ang Ⅱ誘導血管平滑肌細胞表型轉換的影響及機制

李桑柔，劉超利，岳秀青，楊帆，陳睦虎，鐘武

1 西南醫科大學附屬醫院急診醫學部，四川 瀘州 646000；2 四川省康復醫院

血管平滑肌細胞（VSMC）根據細胞結構和功能的不同分為收縮型和合成型兩種表型，收縮型表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）［1］，向合成型轉換時，高表達骨橋蛋白（OPN），導致血管壁張力降低，引發心血管疾病［2-3］。有研究表明，血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的VSMC 表型轉換可能是自噬依賴性的，適度的自噬可促進細胞增殖［4-6］。生物鐘基因使生理活動在24 h 內表現出節律振蕩［7］。Per2 作為轉錄抑制基因，表達生物節律性，低表達的Per2 抑制細胞自噬性凋亡［8-9］。2021 年4 月—2022 年9 月，本研究通過Ang Ⅱ誘導VSMC 發生表型轉換，觀察沉默Per2 和過表達Per2 對VSMC 表型轉換的影響，進一步研究Per2在VSMC表型轉換中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 VSMC 購自武漢普諾賽生物科技有限公司。Ang Ⅱ購自北京索萊寶科技有限公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG 購自上海碧云天生物技術有限公司，DMEM/F12 培養基購自美國Gibco 公司，胎牛血清、0.25% EDTA 胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、無血清細胞凍存液購自賽爾瑞成生命科學技術有限公司，PVDF 膜購自葆光生物技術有限公司，預染蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher 公司，Per2 siRNA、riboFECTTMCP 轉 染試 劑、pcDNA-Per2、pcDNA3.1-3xFlag-C（對照質粒）購自銳博生物科技有限公司，鼠一抗GAPDH、兔一抗β-actin、兔一抗OPN、兔一抗α-SMA、兔一抗Per2、兔一抗LC3、兔一抗p62 購自美國Proteintech 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學發光檢測試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、蛋白質磷酸酶抑制劑購自阿斯本生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 用含10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液+DMEM/F12培養基于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中，選取傳5～10代、狀態良好的VSMC用于實驗。

1.3 細胞轉染 沉默Per2：將VSMC 接種于6 孔板，2×105/孔，將其隨機分為Control A 組、siRNA 組、Per2 siRNA 組，分別給予常規培養、轉染空載siRNA、轉染Per2 siRNA。將細胞培養至30%～50%融合時，按說明書用riboFECTTMCP Buffer 稀釋適量Per2 siRNA，再加入riboFECTTMCPReagent 制備成轉染復合物，室溫孵育15 min，加入無雙抗完全培養基的6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養48 h。Per2過表達：將VSMC接種于6孔板，5×105/孔，將其隨機分為Control B組、pcDNA組、pcDNA-Per2組，分別給予常規培養、轉染空載pcDNA、轉染pcDNA-Per2。將細胞培養至50%～70%融合時，轉染前更換為無雙抗完全培養基，將10 μL FTLipoTM加入250 μL基礎培養基中室溫孵育5 min，將4 μg 高質粒DNA-Per2 加入250 μL基礎培養基混勻，將上述兩種混合物混勻室溫孵育20 min，加入6 孔板，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養6 h，更換為完全培養基繼續孵育48 h。用Western blotting法檢測各組Per2蛋白表達以確認轉染效率。

1.4 Ang Ⅱ干預 根據前期實驗及參考文獻［10］選擇Ang Ⅱ最佳實驗濃度為1×10-7mol/L、最佳干預時間為48 h。選擇部分細胞隨機分為Control C組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 組，分別給予常規培養、1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h、先轉染Per2 siRNA 后再加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h。另選部分細胞隨機分為Control D 組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 組，分別給予常規培養、1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h、先 轉 染pcDNA-Per2 后 再 加 入1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h。

1.5 VSMC內Per2蛋白、表型轉換相關蛋白（α-SMA、OPN）及自噬相關蛋白（p62、LC3）表達檢測 采用Western blotting 法。取出培養箱中VSMC，移去培養基，4 ℃ PBS 洗滌2 次，加入適量的RIPA 冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液至1.5 mL EP 管中-20 ℃保存，采用BCA法測定蛋白濃度，根據上樣量進行濃度調平，100 ℃煮沸5 min 進行蛋白變性，10 μg 蛋白上樣并SDS-PAGE 凝膠電泳，轉移至PVDF 膜上進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗滌1 次5 min，在脫色搖床上一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，各10 min，室溫孵育二抗（1∶1 000 稀釋）1 h，TBST 洗膜3 次，各10 min，ECL 法顯色，置于化學發光儀器中滴入適量ECL 發光液后曝成像，采用Image J 軟件進行灰度定量分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白電泳條帶灰度值/對應GAPDH 電泳條帶灰度值。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism8.0、SPSS26.0軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Per2 siRNA、pcDNA-Per2 的轉染效率 Control A組、siRNA 組、Per2 siRNA 組Per2 蛋白相對表達量分 別 為0.448 ± 0.057、0.431 ± 0.043、0.245 ± 0.090，Per2 siRNA 組Per2 蛋 白 相 對 表 達 量 低 于Control B 組、siRNA 組（P均＜0.05）。Control 組、pcDNA 組、pcDNA-Per2組Per2蛋白相對表達量分別為0.427 ± 0.059、0.432 ± 0.061、0.682 ± 0.063，pcDNA-Per2組Per2蛋白相對表達量高于Control組、pcDNA組（P均＜0.05）。均轉染成功。

2.2 沉默Per2 對表型轉換相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響 見表1。

表1 沉默Per2對表型轉換相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表1 沉默Per2對表型轉換相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響（±s）

注：與Control C組比較，*P＜0.05；與Ang Ⅱ組比較，△P＜0.05。

組別Control C組Ang Ⅱ組Ang Ⅱ+Per2 siRNA組α-SMA 0.729 ± 0.075 0.180 ± 0.087*0.355 ± 0.026△OPN 0.200 ± 0.018 0.891 ± 0.041*0.691 ± 0.057△p62 0.631 ± 0.043 0.079 ± 0.022*0.198 ± 0.038△LC3 0.374 ± 0.106 0.676 ± 0.071*0.445 ± 0.024△

2.3 Per2 過表達對表型轉換相關蛋白及自噬相 關蛋白表達的影響 見表2。

表2 Per2過表達對表型轉換相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響（±s）

表2 Per2過表達對表型轉換相關蛋白及自噬相關蛋白表達的影響（±s）

注：與Control D組比較，*P＜0.05；與Ang Ⅱ組比較，△P＜0.05。

組別Control D組Ang Ⅱ組Ang Ⅱ+pcDNA-Per2組α-SMA 0.673 ± 0.106 0.345 ± 0.066*0.158 ± 0.043△OPN 0.293 ± 0.081 0.437 ± 0.034*0.682 ± 0.041△p62 0.552 ± 0.079 0.325 ± 0.093*0.108 ± 0.016△LC3 0.239 ± 0.035 0.379 ± 0.062*0.503 ± 0.046△

3 討論

VSMC 具有多樣性，就功能而言存在合成型和收縮型兩種表型，當細胞受到一定刺激時，為應對血管損傷，以收縮血管和調節血管的張力、血壓和血流分布為主要功能的VSMC 向合成型發生轉變，收縮型蛋白α-SMA、SM22-α 表達降低，合成型蛋白OPN表達升高，并分泌彈性蛋白酶、金屬蛋白酶等，促使血管病變的發生，從而引起主動脈夾層、高血壓、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、腦卒中等一系列疾病［11-12］。有研究表明，Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統的重要效應分子，可促進VSMC 細胞發生表型轉換。Ang Ⅱ促進VSMC 表型轉換可能是自噬依賴性的［13-14］。在心血管系統中，自噬抵抗外界環境改變對血管的損傷，參與調節細胞物質的合成，并且參與溶酶體降解衰老或者失去功能的細胞、細胞器和變性蛋白質等生物大分子，使降解和重新利用達到平衡，通過信號轉導通路，如PI3K/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路，表達自噬相關蛋白p62、LC3、Beclin1、ATG12 等［14］，在營養、能量不足等病理條件下可以調控細胞物質的重新分配從而維持內環境的穩態［15-16］。然而，過度的自噬會導致內質網應激下病理狀態下的細胞死亡，這種死亡是在生理狀態下是清除無用的細胞和受損的蛋白質的一種保護機制，以維持自噬和細胞凋亡之間的平衡對于細胞發育至關重要［17］。

生物鐘基因廣泛存在于生物界，產生和控制各種生物的生理節律［9］。在哺乳動物中，生理節律的產生主要位于下丘腦視交叉上核，與調節晝夜節律的基因組成了中樞生物鐘，適應全天不同時間不同活動水平的需求，并調節代謝、細胞增殖、生理和行為等各個方面［18-19］。其中基因Per是主鐘基因，可編碼多種蛋白質，若一個氨基酸被取代，就會使周期和轉錄循環發生改變［20］。生物鐘基因Per2 是維持生物鐘功能的重要轉錄抑制因子，研究發現，生物鐘基因Per2 過表達通過PI3K-AKT-mTOR 通路激活細胞自噬，但這種影響是否同樣存在于VSMC 中尚未被證實［21］。NONAKA 等［22］發現，小鼠主動脈中mPer2、Baml1 有明顯的節律振蕩，短暫給予Ang Ⅱ可引起mPer2 基因高表達，隨后引起生物鐘其他成分的同步周期性振蕩。由此猜想，生物鐘基因Per2 可能通過激活細胞自噬參與VSMC 表型轉換。為了進一步探討Per2 與表型轉換的關系，本研究體外構建VSMC 表型轉換模型，通過沉默及過表達Per2 研究Per2對自噬及Ang Ⅱ誘導VSMC表型轉換的影響。

本研究采用Ang Ⅱ在體外誘導VSMC 發生表型轉換，成功構建體外VSMC表型轉換模型。與Ang Ⅱ處理VSMC 比較，轉染Per2 siRNA 后Ang Ⅱ處理的VSMC，發現VSMC 表型轉換、自噬的發生被抑制。而pcDNA-Per2 轉染經Ang Ⅱ處理的VSMC 后，發現促進VSMC 表型轉換及自噬的發生，再次驗證過表達Per2促進自噬的發生，增強VSMC發生表型轉換。

綜上所述，Per2 在VSMC 表型轉換中起重要作用。過表達生物鐘基因Per2 激活細胞自噬，并促進Ang Ⅱ介導的VSMC 表型轉換過程。因此，通過維持正常的生物節律并調控自噬抑制VSMC 表型轉換的發生可能減緩血管病變的進展，同時為心血管疾病提供新的治療靶點。本研究不足之處在于生物鐘基因Per2 具有晝夜節律性，改變正常節律是否對自噬及Ang Ⅱ誘導VSMC 表型轉換產生影響暫未明確；生物鐘基因Per2 如何調控自噬從而影響VSMC表型轉換需進一步研究證實。闡明生物鐘紊亂對VSMC 發生病理生理改變的影響，對指導心血管疾病的治療具有重大意義，未來的研究應關注這些不足，以提供更全面的結果。