ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP對老年靜脈血栓栓塞患者預后的預測價值

張元莉，路彩霞，董素敏，孫美蘭

1 石家莊市人民醫院心血管內科二病區，石家莊 050011；2 河北省滄州中西醫結合醫院急診科；3 河北省滄州中西醫結合醫院介入血管外科；4 石家莊市人民醫院建安病區

老年靜脈血栓栓塞（VTE）是指老年患者血液成分在心臟和靜脈血管腔內形成的血凝塊，常由于機械、感染、免疫和血管自身病變造成血管內皮功能損傷，并通過止血機制促使血栓形成［1］。隨疾病進展，血栓栓子發生脫落后導致組織缺血性改變，嚴重者發生肺栓塞［2-3］。因此早期診斷對老年VTE 治療和預后有重要意義。循環核酸（cfDNA）是指在循環血液中游離于細胞外的DNA，其中包括游離的內源性循環DNA 和外源性循環DNA（ceDNA）。ceDNA 廣泛存在于動物及人體血液中，已成為多種疾病診斷和預后判斷的重要分子標記物，其參與炎癥和血栓的形成與進展［4-5］。核小體是染色質的基本結構單位，通過內源性凝血途徑促進血管內血液凝集，故推測核小體所誘導的凝血可能參與了VTE 的發生。中性粒細胞胞外誘捕網（NET）是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和單核細胞在外在刺激作用下釋放的網狀結構，可以捕獲細菌、真菌等病原微生物，其水平升高可促進炎癥反應，導致周圍組織損傷［6］。VTE 的發生常與慢性感染、免疫有關，IL-18、hs-CRP作為臨床常見的炎癥指標，在VTE 發生時水平會發生相應改變。但目前以上指標在老年VTE 患者中的作用報道較少。故本研究探討ceDNA、循環核小體、NET和炎癥指標對老年VTE 患者預后的預測價值，旨在為臨床診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月—2021 年1 月石家莊市人民醫院收治的老年VTE 患者100 例（VTE組）。納入標準：符合中華醫學會對VTE 的診斷與治療指南［7］，臨床表現為患肢疼痛、腫脹和軟組織張力上升，實驗室檢查D-2 聚體＞500 μg/L，經多普勒超聲檢查確診。排除標準：合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統疾病；臨床資料不完整。并同期選取行VTE 篩查的無VTE 老年人100 例（無VTE 組）。VTE 組男62 例、女38 例，年齡60～71（65.32 ± 2.37）歲，合并高血壓65 例、糖尿病39 例。無VTE 組男65例、女35例，年齡61～70（65.49 ± 2.21）歲，合并高血壓69例、糖尿病34例。兩組性別、年齡、基礎疾病比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 血液標本采集 于入組后采集兩組空腹靜脈血5 mL，置于真空抗凝試管，混勻后采用德國Hettich MIKRO220/220R 離心機離心，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為4 cm，分離血漿、血清。

1.3 ceDNA 檢測 采用激光誘導熒光技術。將檸檬酸鹽血漿在含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）和5 mm EDTA 的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋緩沖液中稀釋20 倍；將50 μL 稀釋的血漿與50 μL 含有熒光DNA嵌入染料的PBS 混合，在多板熒光計中記錄熒光。以無DNA 染料的PBS 混合樣品為背景，測定其自身熒光。

1.4 循環核小體檢測 采用激光誘導熒光技術。用5 μg抗DNA 組蛋白H2A/H2B 復合抗體包被微量滴定板，將板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封閉1 h，并用PBS-Tween（PBS-T）洗滌1 次；將在PBS 中稀釋10 倍的血漿樣品加入孔中，并在37 ℃溫育30 min，用PBS-T 洗滌孔3 次；加入含有1% Picogreen 的PBS，用多板熒光計記錄熒光。

1.5 中性粒細胞胞外誘捕網（NET）檢測 采用激光誘導熒光技術。用1 μg 抗DNA 組蛋白H2A/H2B復合抗體包被微量滴定板，將板用2% BSA 和1%干粉在37 ℃封閉1 h。將血漿在含有2 mmol/L EDTA和0.1% BSA 的PBS 稀釋緩沖液中稀釋20 倍，將稀釋的血漿加入孔中并在37 ℃溫育1 h；清洗培養皿，在37 ℃下與1 μg/mL兔抗人MPO 抗體在0.1% BSA的PBS 中溫育15 min；洗滌后用0.1 μg/mL 辣根過氧化物酶（HRP）結合的山羊抗兔IgG 抗體在37 ℃下孵育15 min，檢測抗MPO 抗體；洗滌后，使用ABTS溶液檢測HRP 活性，從活化的嗜中性粒細胞中分離NET并用作陽性對照。

1.6 血清炎癥指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測IL-18，儀器選擇小型VIPAS 全自動熒光酶標儀，試劑和試劑盒由武漢菲恩生物科技有限公司提供；采用乳膠增強免疫比濁法檢測hs-CRP。選擇VIDAS 型全自動熒光免疫分析儀，試劑和試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司提供，嚴格按儀器與試劑說明書進行操作。

1.7 預后隨訪 3個月后隨訪VTE組存活81例（存活組）、死亡19例（死亡組）。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗。用受試者工作特征（ROC）曲線分析各指標對患者預后的預測價值，曲線下面積比較采用De-Long's test。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VTE 組與無VTE 組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 比較 VTE 組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 高 于 無VTE 組（P均＜0.05），見表1。

表1 VTE組與無VTE組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

表1 VTE組與無VTE組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

組別VTE組無VTE組P n 100 100 ceDNA（FU）100.35 ± 10.28 62.17 ± 6.19＜0.05循環核小體（FU）24.44 ± 2.51 17.71 ± 1.85＜0.05 NET（OD值）0.06 ± 0.02 0.04 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）145.39 ± 14.53 122.27 ± 12.29＜0.05 hs-CRP（mg/L）8.25 ± 1.34 3.14 ± 0.35＜0.05

2.2 存活組與死亡組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 比較 死亡組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 水平高于存活組（P均＜0.05），見表2。

表2 存活組與死亡組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

表2 存活組與死亡組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP比較（±s）

組別死亡組存活組P n 19 81 ceDNA（FU）139.17 ± 11.32 91.23 ± 9.52＜0.05循環核小體（FU）28.34 ± 2.85 23.52 ± 2.16＜0.05 NET（OD）0.08 ± 0.02 0.05 ± 0.01＜0.05 IL-18（ng/mL）185.37 ± 15.34 135.69 ± 13.34＜0.05 hs-CRP（mg/L）10.14 ± 1.29 7.83 ± 0.66＜0.05

2.3 ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 對VTE 患者預后的預測價值 ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP 單獨及聯合檢測預測VTE 患者預后的曲線下面積分別為0.731、0.674、0.707、0.658、0.665、0.847，聯合檢測預測價值更高（P均＜0.05），見表3。

表3 ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP對VTE患者預后的預測價值

3 討論

研究發現，血栓形成與機體固有免疫系統關系密切，其中中性粒細胞可釋放NET 促進血栓形成，ceDNA 表達水平可在一定程度上反映血栓內NET的形成［8］。因此ceDNA逐漸引起學者關注。

ceDNA 具有雙螺旋結構，可單獨游離于血液中，也可以復合體形式存在，其作用是進入人體細胞并傳遞遺傳信息。研究顯示，肺血栓患者線粒體DNA 水平、核DNA（nDNA）和ceDNA 水平顯著高于健康人群，但恢復期ceDNA 水平與健康人群無明顯差異［9］。核小體核心是由H2A、H2B、H3 和H4 各兩分子組成的8 聚體，長度大約為146 bp 的DNA 負超螺旋所構成。當細胞死亡時，Caspases 蛋白酶被激活，核酸內切酶與核小體連接區結合并將染色質分解為多聚寡核苷酸與單核小體，參與循環的核小體就稱為循環核小體。既往研究顯示，當機體發生炎癥反應時，免疫系統受到刺激，細胞死亡率升高，循環核小體清除減少［10］。NET是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA 支架組成的胞外網狀結構，包含多種活性物質，而細菌、病毒、真菌及癌細胞等因素可通過復雜的活化模式誘導中性粒細胞形成NET。已有研究顯示，NET 相關蛋白已顯示出誘導內皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循環中NET cfDNA 組蛋白在炎性作用下被NET 釋放，加劇炎性損害，造成惡性循環［11］。IL-18 是具有多種生物活性的炎癥因子，參與免疫調節與炎癥反應，其作用于血管內皮細胞，并促使細胞凋亡信號活化，導致細胞生長與功能異常，激活血管內皮細胞核因子-κB（NF-κB）進而誘導內皮因子死亡。NF-κB頻繁激活可調節機體多種炎癥因子水平，促進炎癥進展，引起細胞損傷［12］，引發靜脈血管內皮細胞的生理功能障礙，促進血栓進展。hs-CRP 是具有高敏感性的炎癥指標，在機體受到損傷時顯著升高，誘導單核細胞合成組織因子，激活外源性凝血途徑，促使VTE形成。

本研究發現，VTE 組ceDNA、循環核小體、NET 、IL-18、hs-CRP高于無VTE組。推測原因可能是由于VTE 患者內皮細胞的生理功能發生障礙，使血液中ceDNA含量增加，誘導中性粒細胞形成NET，加劇了內皮細胞炎性損害，釋放大量炎癥因子（IL-18、hs-CRP等），且激活血管內皮細胞中相關信號通路，引起內皮細胞損傷，進一步促進血栓的發展。本研究隨訪3個月，存活組ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP水平高于死亡組。提示ceDNA、循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP對VTE患者的預后具有預測價值。且ROC分析可見，ceDNA預測VTE患者預后的曲線下面積高于循環核小體、NET、IL-18、hs-CRP。研究顯示，ceDNA 是老年VTE 患者死亡的獨立預測因子［13］，這與本研究中部分觀點一致；且研究結果顯示以上指標聯合檢測對VTE 患者預后有較高的預測價值。提示ceDNA 有望成為預測VTE 預后的分子標志物，但單一檢測易造成誤檢與漏檢，故可與其他指標聯合檢測以提高預測效能。

綜上所述，臨床可通過聯合檢測ceDNA、循環核小體、NET、IL-18 和hs-CRP 預測VTE 預后，并通過控制炎癥及細胞內皮損傷改善患者預后。