血清miR-92a、miR-17、miR-19b 對冠心病患者冠狀動脈病變程度的評估價值

王雙雙，張斌強，錢航，徐先琳，陳孝強，唐俊，翟宇新，陳繼舜

湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院心內科，湖北 十堰 442008

我國心腦血管疾病的發病率仍處于上升趨勢，病死率居總死亡原因之首，其中冠心病（CAD）患者1 139 萬［1］。CAD 主 要病 理 基礎 為動脈 粥樣 硬化（AS），其作為一種慢性動脈病變，可由氧化應激、炎癥反應、脂質代謝異常、內皮細胞功能障礙等因素引起［2］。心源性猝死最常見的病因亦為CAD［3］，因此對CAD 早期診斷及干預至關重要。微小RNA（miRNA）作為一類高度保守的內源性非編碼RNA，具有復雜的生物學功能，其可通過調控多種機制參與AS的發生發展［4］。miRNA 在病理狀態下水平變化常早于其他循環生物標志物，故可作為心腦血管疾病早期診斷的新型生物標志物［5-6］。miR-92a、miR-17、miR-19b 作為miRNA 的重要分型，已有研究通過建立動物模型發現三者參與了AS 的發生發展［7-8］。然而，上述miRNA 在冠狀動脈（冠脈）疾病中的作用臨床性研究相對較少。因此本研究擬通過檢測CAD患者血清中miR-92a、miR-17、miR-19b 表達，探討三者與冠脈病變程度的關系，旨在為臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2021 年7 月因胸悶胸痛不適就診于本院心內科的92例患者，均行冠脈造影檢查，依據造影檢查結果分為對照組30例（未見冠脈狹窄或狹窄均＜50%）和CAD 組62 例（冠脈主要血管中至少有1 支狹窄程度≥50%）。排除先天性心臟病、心肌病、急性心衰、嚴重肝腎功能、血液風濕性疾病及惡性腫瘤等。兩組均簽署知情同意書，本研究已通過醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 資料收集 收集各組以下資料：性別、年齡、收縮壓、舒張壓及血生化指標（TG、LDL-C、HDL-C、血尿酸、總膽紅素等）。

1.3 血清miR-92a、miR-17、miR-19b 表達檢測 均于入院24 h 內抽取空腹靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），分離血清，于-80 ℃冰箱保存。用天根RNA 提取試劑盒分離miRNA，用加尾法對提取的miRNA 行逆轉錄，得到其對應的cDNA 第一鏈。后采用實時熒光定量PCR 法對miR-92a、miR-17、miR-19b 進 行 擴 增，以 外 參（CR100）為參照。反向引物由天根試劑盒提供。引物：miR-92a 序列為UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU、miR-17 序 列 為CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG、miR-19b 序 列 為 UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA。反應體系：2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL、Forward Primer和miRNA第一鏈cDNA各2 μL、Reverse Primer 0.4 μL，最后加入DEPC-H2O至反應溶液20 μL。反應條件：95 ℃ 預加熱15 min；94 ℃變性20 s、75 ℃延伸30 s，共40 個循環。以2-ΔΔCT法計算miRNA相對表達量

1.4 冠脈病變程度判定 采用Gensini 評分［9］評估CAD 組冠脈病變情況。冠脈狹窄程度≤25%計1分、管腔狹窄＞25%～50%計2 分、管腔狹窄＞50%～75%計4 分、管腔狹窄＞75%～90%計8 分、管腔狹窄＞90%～99%計16分、管腔狹窄＞99%計32分；冠脈不同分支病變系數：左主干為5.0，左前降支近段、中段、遠段為2.5、1.5、1.0，左回旋支近段為2.5，左回旋支中段、遠段及右冠動脈為1.0，小分支為0.5。節段積分為血管狹窄評分乘以病變系數，最終評分即為各節段積分之和。依據Gensini 評分［10］將CAD 患者分為低評分組（≤40分）32例、高評分組（＞40分）30例。

1.5 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗；非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。用多因素Logistic 回歸分析CAD 發生的影響因素；Spearman 相關分析法分析血清miRNA 表達與Gensini 積分的相關性；繪制受試者工作特征（ROC）曲線評價血清miRNA對CAD病情的預測價值，曲線下面積比較采用Z檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、C AD組臨床資料比較 CAD組HDL-C低于對照組（P＜0.05），兩組其他臨床資料比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 對照組、CAD組臨床資料比較

2.2 對照組、CAD 組血清miR-92a、miR-17、miR-19b表達比較 CAD 組血清miR-92a、miR-17相對表達量高于對照組，血清miR-19b 相對表達量低于對照組（P均＜0.05）。見表2。

表2 對照組、CAD組血清miR-92a、miR-17、miR-19b表達比較［M（P25，P75）］

2.3 CAD發生的影響因素 將CAD作為因變量，以HDL-C、miR-92a、miR-17、miR-19b為自變量納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示miR-92a、miR-17表達升高為CAD發生的危險因素（P均＜0.05），而miR-19b表達升高為CAD發生的保護因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 CAD發生影響因素的Logistic回歸分析

2.4 低評分組、高評分組血清miRNA 相對表達量的比較 低評分組Gensini 積分為（20.98 ± 1.68）分、高評分組Gensini 積分為（73.10 ± 3.98）分。高評分組血清miR-92a、miR-17 相對表達量高于低評分組，血清miR-19b 相對表達量低于低評分組（P＜0.05）。見表4。Spearman 相關分析結果顯示，CAD患者血清miR-92a、miR-17 相對表達量與Gensini 積分呈正相關（rs分別為0.529、0.519，P均＜0.05），血清miR-19b 相對表達量與Gensini 積分呈負相關（rs=-0.579，P＜0.05）。

表4 低評分組、高評分組血清miR-92a、miR-17、miR-19b表達比較［M（P25，P75）］

2.5 血清miR-92a、miR-17、miR-19b表達對CAD 患者冠脈病變程度的評估價值 ROC 分析曲線顯示，血 清miR-92a、miR-17、miR-19b 及 三 者 聯 合 評 估CAD 患者冠脈病變程度的曲線下面積分別為0.806（95%CI：0.695～0.917）、0.800（95%CI：0.689～0.911）、0.834（95%CI：0.737～0.932）、0.967（95%CI：0.930～1.000）。三者聯合評估CAD 患者冠脈病變程度的曲線下面積高于單獨評估（P均＜0.05）。見表5。

表5 血清miR-92a、miR-17、miR-19b表達對CAD患者冠脈病變程度的評估價值

3 討論

研究表明，CAD 是多種危險因素作用于不同環節所致。冠脈AS 是CAD 發病的重要病理生理基礎。miRNA 是一類由21～25 個核苷酸序列組成的存在于真核微生物中的保守單鏈非編碼RNA，可參與心臟、肌肉等器官正常生長發育，其異常表達時亦可在心腦血管疾病的演變中扮演重要角色［11-12］。miRNA 可通過參與調控內皮細胞損傷、炎癥反應、脂質代謝、血管平滑肌細胞增殖等過程，影響AS 發生發展［13］。近年來，miRNA 與心血管疾病的關系一直是備受關注的焦點問題。因此本研究選定3 個miRNA（miR-92a、miR-17、miR-19b），以探索其在評估CAD嚴重程度方面的價值。

本研究發現，CAD 組及CAD 患者高評分組中miR-92a、miR-17 高表達，而miR-19b 則低表達；且多因素Logistic分析顯示，miR-92a、miR-17、miR-19b為CAD 發生的影響因素。表明在CAD 發生發展中miR-92a、miR-17 可能發揮著促AS 作用，而miR-19b則可能起到抗AS作用。

動物實驗表明miR-92a 在糖尿病小鼠主動脈內皮細胞上呈高表達，拮抗miR-92a 表達可減輕血管內皮細胞氧化應激反應，進而起到血管保護作用［14］。LIU 等［15］證實，在小鼠老化血管內皮細胞中表達上調的miR-92a 可作用于Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1），上調Keap1 表達，同時也下調了核因子E2 相關因子2 或抗氧化反應元件的表達，進而加速內皮細胞衰老，引起內皮細胞功能障礙。本研究發現，CAD 患者血清中miR-92a 相對表達量高于對照組，且高評分組血清miR-92a 相對表達量高于低評分組，說明miR-92a 在CAD 患者血清中呈高表達，且參與冠脈病變進展。提示miR-92a 可能通過調控氧化應激、細胞衰老等過程參與CAD 進程，可能發揮著促AS 作用。動物實驗發現，與正常小鼠相比，AS 模型小鼠巨噬細胞中miR-17 表達升高，且當給予AS 小鼠拮抗miR-17 處理后，炎癥因子的產生及脂質堆積顯著下調［16］。本研究發現，CAD患者血清中miR-17 相對表達量高于對照組，且高評分組患者血清miR-17 相對表達量高于低評分組，說明miR-17在CAD患者血清中呈高表達，并且隨著冠脈病變進展而進一步增加。提示miR-17 可能通過調控炎癥反應、脂質代謝等過程參與CAD 進展，亦可能發揮著促AS 作用。關于miR-19b，2017 年有報道稱，miR-19b 可通過抑制細胞因子信號轉導抑制劑（SOCS3）表達，促進下游炎癥介質釋放，加速AS發展［17］。但近年來關于miR-19b同CAD的相關研究較少且存在爭議。有研究報道，miR-19b 在氧化型低密度脂蛋白誘導構建的人臍靜脈血管內皮細胞AS 模型中呈低表達，而在正常血管壁內高表達，提示miR-19b 也可能與AS 的發生發展相關［18］。TANG等［19］也發現，升高miR-19b表達可抑制下游炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α所誘導的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡。SINGH等［20］研究進一步證實，在miR-19b低表達患者中發生心血管不良事件的風險愈高。而在本研究中證實CAD 組血清miR-19b 呈低表達，且隨著患者病情進展而進一步降低，提示miR-19b 可能在CAD 中出現異常表達，且其低表達可能參與CAD病情加重。故我們推測，miR-19b 既可通過影響SOCS3信號因子表達來增加血管周圍脂質組織炎癥因子釋放發揮促炎作用，又可通過凋亡酶激活因子-1/Caspase 信號通路發揮抑炎作用，但最終來說miR-19b 在CAD 發生發展發揮著抗AS 效應，但具體機制仍需進一步探索。

CAD 的嚴重程度與其病死率密切相關，因此對冠脈病變程度評估至關重要［21］。冠脈病變程度的量化可通過Gensini評分實現，這是臨床上廣泛使用的一種評分系統，其積分越高提示冠脈病變程度越重［22］。相關性分析顯示，CAD 患者血清中miR-92a、miR-17 相對表達量與Gensini 積分呈正相關，miR-19b 相對表達量與Gensini 積分呈負相關，證明CAD患者血清中miR-92a、miR-17、miR-19b 相對表達量與患者病情嚴重程度相關。經ROC 曲線分析，得出三者聯合檢測AUC 為0.967 高于單項指標檢測，說明聯合檢測對評估CAD患者病情進展效能更高。

綜上所述，CAD 患者血清miR-92a、miR-17 表達升高，miR-19b 表達降低，均與患者冠脈病變程度相關。本研究局限性在于尚未探索上述miRNA 在CAD 發生發展中的具體作用機制，此外本研究樣本量少，在未來仍需要大量樣本來驗證本結論。