獨活-牛膝藥對治療膝骨關節炎的網絡藥理學機制及實驗驗證

張永奎 ， 李念虎 ， 井成 ， 王象鵬 ， 宋緒鈺 ， 畢榮修 ， 謝文鵬

（1.山東中醫藥大學附屬醫院骨科，山東濟南 250000；2.山東福牌制藥有限公司，山東濟南 250000；3.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250000；4.山東大學第二醫院，山東濟南 250000）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是以關節軟骨破壞和軟骨下骨硬化為最根本病理改變的退變性疾病[1]。最新流行病學研究資料顯示，KOA的發病率隨著老齡化的加重呈現出升高的趨勢[2-3]。因此，尋求安全有效的治療方案對于克服此病的危害有著重要的社會意義。

伴隨著臨床治療方案的增多，2018 年版《骨關節炎診療指南》[4]首次將中成藥寫進了KOA 的治療方案之中，但遺憾的是尚未詳細介紹其適應證和用法。隨后2020 年遵循“循證為主、共識為輔、經驗為鑒”的研究原則，制定了《中成藥治療膝骨關節炎臨床應用指南（2020 年）》[5]，明確了中成藥的種類、用法及適應證，為中成藥在膝骨關節炎中的規范使用奠定了基礎。通過總結諸多醫家對KOA 治療的用藥特點及規律，在中醫理論指導下，本課題組創制了院內制劑蒼膝通痹膠囊（魯藥制字Z20130043），并進行了相關的療效研究，發現其治療KOA療效明確、安全性高[6]，并對其作用機制進行了探討，發現蒼膝通痹膠囊可以通過靶向阻斷p38MAPK 信號通路來保護關節軟骨[7]；但是不能明確其具體的作用成分，使其臨床推廣面臨困難。由此，本研究選取其君藥獨活-牛膝藥對作為研究對象進行機制探討，預實驗結果證實獨活-牛膝藥對可以有效抑制軟骨細胞凋亡，減輕KOA炎性反應，但其機制尚未明確。

網絡藥理學具有數據挖掘、靶點預測和功能分析等多種功能，推動了中藥復方藥效分子機制的研究進展[8]。本研究基于網絡藥理學，篩選和預測獨活-牛膝藥對治療KOA的潛在作用靶點和信號通路，并通過體外實驗進行驗證，以期為獨活-牛膝藥對的臨床應用提供藥理學依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1 獨活-牛膝藥對有效成分及作用靶點篩選 應用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、《中國藥典》 2020 年版（http://db.ouryao.com）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）等數據庫得到獨活、牛膝所有可能的有效成分，根據口服利用度（OB）大于30%和類藥性（DL）大于0.18篩選得出符合條件的有效成分，不符合上述標準但是《中國藥典》含量測定標準提及到的成分也納入該研究，篩選去重后應用TCMSP 數據庫確定有效成分作用靶點，并去重。

1.1.2 KOA 靶點的獲取及與獨活-牛膝藥對靶點的交集分析 運用GeneCards（https://www.genecards.org）和OMIM數據庫以“knee osteoarthritis”為關鍵詞獲取KOA 靶點，并去重。應用OmicShare（https://www.omicshare.com）將活性成分靶點與KOA 靶點進行交集，得到交集靶點和韋恩（Venn）圖。

1.1.3 蛋白相互作用（PPI）網絡構建 通過STRING 數據庫（https://string-db.org）對上述交集靶點進行PPI 網絡分析。物種參數設置為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設置為0.9，并隱藏游離點得到蛋白質相互調控網絡。將該網絡導入Cytoscape 3.6.0，進行拓撲屬性分析，構建疾病-活性成分-靶點網絡圖，并利用R（x64 4.0.2）軟件篩選連接節點數排前30 位的靶點作為獨活-牛膝藥對治療KOA的核心靶點。

1.1.4 基因本體論（GO）分析富集分析 使用R（x64 4.0.2）軟件將獨活-牛膝藥對治療KOA 的交集靶點名稱轉換成ID，利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov）以及在R 軟件中調用生物類的程序包對關鍵靶點進行GO 富集分析（P＜0.01），通過對基因的富集分析預測獨活-牛膝藥對治療KOA的可能機制。

1.1.5 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 使用R軟件對交集靶點進行KEGG富集分析（P＜0.05），得到KEGG 富集分析具體通路信息。

1.1.6 分子對接驗證 將篩選得到的前5 位核心靶點與相應活性成分進行分子對接驗證。從PDB數據庫（https://www.rcsb.org）中搜索靶點蛋白的PDB ID，并用PyMol 1.0.0.0 刪除水分子；同時在Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫下載對應成分的2D 結構，并應用Chem3D 19.0 軟件進行優化轉化， 將受體和配體信息導入AutoDockTools 1.5.6 軟件，進行分子對接，選擇bindingenergy 最低的構象保存后應用Discovrey Studio進行顯示。

1.2 細胞驗證

1.2.1 細胞模型構建與給藥 4只1周齡SPF級健康雄性、體質量10 ～20 g 的SD 大鼠，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）20190003；實驗單位：山東中醫藥大學附屬醫院，使用許可證號：SYXK（魯）2018001；本研究方案已獲得山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理審查委員會審批，批號：2021-04。取4 只大鼠的關節軟骨組織，采用胰酶-Ⅱ型膠原酶2 步酶消化法獲得原代軟骨細胞，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養。以10 ng·mL-1的IL-1β[9（]美國R&D Systems 公司產品）溶液干預正常培養的軟骨細胞24 h，得到退變軟骨細胞模型，作為后續實驗研究對象。將細胞隨機分為空白組、模型組及槲皮素（MedChemExpress 公司，批號：HY-18085）低、中、高濃度組（25、50、100 μmol/L[10]，槲皮素先用DMSO 溶解，然后用培養基稀釋成對應的濃度，最終DMSO 的濃度均小于0.1%），相應藥物干預24 h。

1.2.2 Western Blot 法 檢 測 細 胞 TP53、MMP9、VEGFA 蛋白表達 取對數期各組細胞，使用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）測定試劑盒檢測蛋白濃度，制作上樣液。每樣品孔30 μg蛋白的標準加樣，加樣后依次進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫環境在搖床上使用脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入按體積比稀釋的一抗（由武漢三鷹公司生產）包括TP53（1∶5 000）、MMP9（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、GAPDH（1∶50 000），4 ℃孵育過夜。次日，PBS 洗滌3 次，每次5min，加入辣根酶標記兔抗山羊IgG（H+L）（由北京中杉金橋公司生產，按體積比1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h后，進行顯影曝光，分析灰度值。

1.2.3 RT-PCR法檢測細胞TP53、MMP9、VEGFA mRNA 表達 取對數期各組細胞，TRIzol 法提取RNA，使用Nanodrop 2000 分光光度計檢測各組RNA 濃度。按照Roche 反轉錄試劑盒使用說明書將mRNA 反轉錄得cDNA，使用LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀進行擴增和檢測。使用25 μL反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，共 45 個循環；溶解曲線：95 ℃5 s，65 ℃1 min；冷卻。采用2-ΔΔCt法進行基因定量計算。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 統計方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，正態分布數據多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊采用LSD 檢驗，方差不齊采用Games-Howell 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 獨活-牛膝藥對活性成分及靶點篩選 以OB ≥30%、DL ≥0.18 作為篩選條件，不符合上述標準但是《中國藥典》含量測定標準中提及到的獨活、牛膝成分也納入該研究，篩選去重后共得到14個活性成分（betavulgarin、rubrosterone、betasitosterol、quercetin、ammidin、isoimperatorin、OAcetylcolumbianetin、angelol D、[（1R，2R）-2，3-dihydroxy-1-（7-methoxy-2-oxochromen-6-yl）-3-methylbutyl]（Z）-2-methylbut-2-enoate、angelicone、[（1R，2R）-2，3-dihydroxy-1-（7-methoxy-2-oxochromen- 6- yl）- 3- methylbutyl] （Z） - 2-methylbut-2-enoate、nodakenin、osthole、zosimin），其中牛膝4 個、獨活10 個。共有對應靶點340 個，篩選去重最終得到活性成分靶點171個。

2.2 KOA 靶點的獲取及與獨活-牛膝藥對靶點的交集分析 以“knee osteoarthritis”為關鍵詞，通過檢索GeneCards、OMIM 等數據庫，篩選去重后，共得到2 040個KOA疾病相關靶點。將上述活性成分靶點及疾病靶點，導入OmicShare，繪制韋恩（Venn）圖，并得到交集靶點99個，如圖1所示。

圖1 獨活-牛膝藥對活性成分靶點與膝骨關節炎（KOA）靶點交集韋恩（Venn）圖Figure 1 Venn diagram of the intersection of the active component targets of the Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair and the KOA targets

2.3 PPI網絡構建 通過STRING 數據庫對上述交集靶點進行PPI 網絡分析，物種參數設置為“Homo sapiens”，“minimum required interaction score”設置為0.9，并隱藏游離點得到蛋白質相互調控網絡（如圖2）。將該網絡導入Cytoscape 3.6.0軟件，進行拓撲屬性分析，構建疾病-活性成分-靶點網絡圖（如圖3），并利用R軟件篩選連接節點數排前30 位的靶點作為獨活-牛膝藥對治療KOA的核心靶點（如圖4）。

圖2 獨活-牛膝藥對靶點PPI網絡Figure 2 PPI network of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair targets

圖3 獨活-牛膝藥對活性成分-膝骨關節炎（KOA）-靶點相互作用網絡圖Figure 3 Interaction network diagram of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair active component-KOA-target

圖4 獨活-牛膝藥對治療膝骨關節炎（KOA）的核心靶點Figure 4 The core targets of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair for treating KOA

2.4 GO 富集分析結果 使用R（x64 4.0.2）軟件將獨活-牛膝藥對治療KOA 的交集靶點名稱轉換成ID，利用DAVID 數據庫以及R 軟件對關鍵靶點進行GO 富集分析（P＜0.01），得到GO 富集分析結果，如圖5（顯示前20個功能），主要有炎癥反應、細胞代謝、調節蛋白激酶及磷酸酶活性等。

圖5 獨活-牛膝藥對活性成分潛在靶點參與的生物學過程分析Figure 5 Analysis of biological processes involving potential targets of active components of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair

2.5 KEGG 富集分析結果 使用R 軟件對交集靶點進行KEGG 富集分析（P＜0.05），得到KEGG 富集分析具體通路信息，如圖6，主要有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、癌癥通路（pathways in cancer）等。

圖6 獨活-牛膝藥對治療膝骨關節炎（KOA）的KEGG通路富集分析Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis of Angelicae Pubescentis Radix and Achyranthis Bidentatae Radix drug pair in the treatment of knee osteoarthritis（KOA）

2.6 分子對接結果 將篩選得到的前5 位核心靶點IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 與相應活性成分槲皮素（quercetin）進行分子對接驗證，結果顯示，獨活-牛膝藥對中槲皮素與IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53等關鍵靶點有較好的結合能力。結果如表2所示。從分子對接分數可以判斷活性成分與相關潛在靶點的結合程度，總分絕對值大于5.0 表明，活性成分與靶點有較好的結合活性，總分大于7.0表明，分子與靶點具有強烈的結合活性（分子對接模式見圖7）。分子對接結果驗證了網絡藥理學研究結果的可靠性。

圖7 分子對接模式圖Figure 7 Molecular docking model diagram

表2 分子對接結果Table 2 Molecular docking results

2.7 槲皮素對KOA軟骨細胞TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白表達水平的影響 圖8結果顯示，與空白組比較，模型組細胞中TP53、VEGFA、MMP9 mRNA 及蛋白的表達水平明顯升高（P＜0.05），經過不同濃度槲皮素干預的細胞中TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白的表達水平均明顯降低（P＜0.05），均呈濃度依賴性。

圖8 各組軟骨細胞TP53、VEGFA、MMP9 mRNA及蛋白表達比較Figure 8 Comparison of mRNA and protein expressions of TP53，VEGFA and MMP9 in chondrocytes among various groups

3 討論

關節軟骨損傷是退變性膝骨關節炎（KOA）病理進程中最核心的病變之一，保護關節軟骨已成為KOA治療的核心靶點。本研究結果顯示，獨活-牛膝藥對中有14個有效活性成分、作用于KOA的潛在靶點有171 個。進行成分-靶點網絡拓撲學分析則顯示，槲皮素對應靶點最多。既往研究表明，槲皮素[11-12]可減少促炎性細胞因子生成、調控炎癥相關信號通路，抑制細胞外基質降解，可有效治療KOA。本課題組前期研究[10，13]也發現，槲皮素可以靶向阻斷p38MAPK信號通路來保護關節軟骨。

本研究PPI 網絡結果顯示，獨活-牛膝藥對治療KOA 核心靶點主要有IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 等。白細胞介素6（IL-6）是介導炎癥反應的核心因子，可激活KOA 軟骨細胞的炎性反應，進而促進軟骨細胞的分解代謝，加速軟骨細胞退變[14-15]。基質金屬蛋白酶9（MMP9）可以降解軟骨基質中大部分成分，其中最主要的是通過降解膠原蛋白和蛋白多糖來加速軟骨基質的分解代謝，進而導致軟骨細胞逐漸發生凋亡壞死，導致炎癥反應的加速和KOA病理進程的加重[16]。RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）通過酶的活性作用在調控軟骨細胞各種生物進程中起重要作用，在KOA軟骨內，AKT1的活性明顯降低，其mRNA 表達和磷酸化水平同時下調[17]。血管內皮生長因子（VEGFA）可促進血管的新生，加速膝關節營養物質的交換以及炎性產物的代謝，進而加速KOA 的病理進程[18-19]。TP53 具有抑制DNA 復制，阻斷細胞周期，導致細胞凋亡，加速軟骨降解的作用[20]。提示獨活-牛膝藥對可能通過調節以上靶點治療KOA，且分子對接結果表明獨活-牛膝藥對活性成分與核心靶點均有良好的結合能力。

本研究KEGG 富集分析顯示，獨活-牛膝藥對治療KOA 核心靶點主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、癌癥通路等，這些通路均是介導炎癥反應的重要通路，均與KOA 的發生發展、炎癥反應程度及軟骨細胞的凋亡等進程息息相關。TNF-α 可激活轉錄因子NF-κB和MAPK信號通路，進而促進MMPs的產生，并誘導IL-6、IL-1β等炎癥因子產生，加劇軟骨的破壞[21-22]。IL-17 可誘導炎性反應的加重和關節軟骨的降解，既往研究表明，IL-17在KOA中表達顯著升高，且其表達量與KOA 的嚴重程度呈正相關[23]。通過KEGG 富集分析結果可以看出獨活-牛膝藥對治療KOA 具有多靶點、多途徑的特點，但主要是通過下調細胞因子表達、抑制炎癥反應、減慢軟骨降解退變來延緩KOA的進展。

最后，本研究使用了分子對接技術，取前5位核心靶點IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53 與相應活性成分槲皮素進行分子對接驗證，結果顯示，獨活-牛膝藥對中槲皮素與IL-6、MMP9、VEGFA、AKT1、TP53等關鍵靶點均能結合，其中與MMP9、VEGFA、TP53的結合分數大于5，提示結合活性較好。且體外實驗通過Western Blot 及RT-PCR 實驗驗證了有效成分槲皮素能抑制KOA軟骨細胞中MMP9、VEGFA、TP53 的表達，證實了獨活-牛膝藥對治療KOA的靶向作用。

綜上所述，本研究遵循網絡藥理學評價方法指南，采用網絡藥理學及分子對接的方法，系統闡述了獨活-牛膝藥對治療KOA的作用機制，挖掘出了多個潛在的治療靶點并通過體外實驗進行了驗證。在后續研究中，要進一步應用中藥復方的研究方法，鑒別獨活-牛膝藥對中有效的藥物成分，并且對網絡藥理學篩選出的關鍵通路進行驗證，從而為獨活-牛膝藥對的機制研究及臨床推廣提供新的思路和依據。