miR-146a-5p對(duì)HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)因子IRAK-1表達(dá)的影響

孫雅楠　尹明潔　米穎　李斯

【摘要】? 目的? 檢測(cè)miR-146a-5p對(duì)肝HepG2細(xì)胞白介素受體相關(guān)激酶-1（IRAK-1）表達(dá)的作用，以及在牙齦卟啉單胞菌P.gLPS（P.gLPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)下，miR-146a-5p對(duì)IRAK-1的作用。方法? 通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、P.gLPS刺激以及miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染、細(xì)胞蛋白提取及蛋白免疫印跡法等方法，檢測(cè)HepG2細(xì)胞miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組（A組）、P.gLPS刺激組（B組）、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組（C組）以及陰性對(duì)照組，比較各組IRAK-1 mRNA及蛋白變化。結(jié)果? 四組IRAK-1蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異存在意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，除了陰性對(duì)照組與C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? miR-146a-5p能夠抑制HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中miR-146a-5p通過(guò)抑制IRAK-1的表達(dá)發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。

【關(guān)鍵詞】? microRNA-146a-5p；HepG2細(xì)胞；牙齦卟啉單胞菌；白介素受體相關(guān)激酶-1；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；免疫印跡試驗(yàn)

中圖分類號(hào)? R575.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? 文章編號(hào)? 1671-0223（2023）07--03

HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株，其表型及細(xì)胞功能與肝細(xì)胞相似，具有肝細(xì)胞所特有的生物學(xué)特性，如脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、糖調(diào)節(jié)及RNA的合成等，目前在肝細(xì)胞相關(guān)的脂代謝、炎癥反應(yīng)及能量代謝等研究中被用來(lái)建立肝細(xì)胞模型[1-3]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中并且能夠調(diào)節(jié)生理病理反應(yīng)的重要因子，其中miR-146a-5p在人類免疫調(diào)節(jié)功能中具有重要的作用。研究顯示，細(xì)胞中、組織液中以及血漿中的miR-146a-5p具有抑制炎癥反應(yīng)，防止炎癥反應(yīng)放大的作用[4-5]。白介素受體相關(guān)激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）是一類炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體自身免疫過(guò)程中通過(guò)調(diào)整炎癥因子的表達(dá)量[6-7]激活氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用，具有加重炎癥反應(yīng)，影響人體正常的生理作用。但是miR-146a-5p是否對(duì)HepG2細(xì)胞中的炎癥調(diào)節(jié)因子IRAK-1表達(dá)水平產(chǎn)生影響，以及在牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalislipopolysaccharide，P.gLPS）刺激細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-146a-5p是否仍能發(fā)揮一定的抑制炎癥反應(yīng)的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-146a-5p HepG2細(xì)胞以及P.gLPS刺激后的HepG2細(xì)胞，觀察IRAK-1蛋白表達(dá)水平，闡明miR-146a-5p對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1? 資料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)的HepG2細(xì)胞系由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心所提供，分為4組：①陰性對(duì)照組：?jiǎn)渭兗?xì)胞培養(yǎng)，無(wú)轉(zhuǎn)染及炎癥刺激，培養(yǎng)條件與各組相同；②A組：細(xì)胞經(jīng)miR-146a-5p mimics細(xì)胞轉(zhuǎn)染；③B組：細(xì)胞經(jīng)P.gLPS刺激；④C組：細(xì)胞經(jīng)miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染及P.gLPS刺激。

1.2? 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮中凍存的細(xì)胞在試管中進(jìn)行復(fù)蘇，在復(fù)蘇后的細(xì)胞試管中沿管壁逐步輕柔加入一定的DMEM培養(yǎng)液，進(jìn)一步將復(fù)蘇后的細(xì)胞稀釋，濃度為105/ml。將細(xì)胞輕柔轉(zhuǎn)移至干燥的培養(yǎng)瓶中，并且在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)再次培養(yǎng)，CO2濃度為37%，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞，如觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，至鋪滿整個(gè)瓶壁，可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。

1.3? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及炎癥刺激

1.3.1? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染? 用吸管輕柔的吸取250μl miR-146a-5pmimics轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將其緩慢加入到細(xì)胞孔板中，進(jìn)一步吸取Opti-MEM培養(yǎng)基，按照750μl/孔的量加入，輕柔混合均勻。設(shè)定培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37℃、CO2濃度5.0﹪、飽和濕度，培養(yǎng)24h。經(jīng)轉(zhuǎn)染6h后，吸取1ml普通DMEM培養(yǎng)基緩慢的加入各培養(yǎng)孔。

1.3.2? 炎癥刺激? B組與C組在實(shí)驗(yàn)中分別加入P.gLPS的濃度為1μg/ml，在培養(yǎng)6h后收獲細(xì)胞，并用于后續(xù)的蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.4? Western blot細(xì)胞內(nèi)蛋白的檢測(cè)

細(xì)胞在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染清洗之后，進(jìn)一步應(yīng)用RIPA裂解上述實(shí)驗(yàn)處理過(guò)的細(xì)胞，并獲得實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)的總蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)一步測(cè)定所提取的蛋白濃度行SDS-PAGE電泳。取目的蛋白條帶，在恒流電為200毫安的電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用TBST水清洗，進(jìn)一步進(jìn)行封閉實(shí)驗(yàn)：將膜輕柔放于封閉液中，并在搖床上進(jìn)行封閉1h。配制一抗體與一抗稀釋液（比例為按1∶100或1∶200），將封閉好的膜首先放入一抗稀釋液，4℃搖床過(guò)夜。配制二抗與二抗稀釋液（按1∶1000或1∶2000的比例），之后將膜放入配好的二抗稀釋液，在常溫的條件下，將膜輕柔放在搖床上搖3h。在二抗孵育實(shí)驗(yàn)完成之后，用TBST清洗3次，進(jìn)一步加入顯色液，并在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯色，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5? 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正態(tài)分布的計(jì)量資料使用“±s”表示，四組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法檢驗(yàn)。

2? 結(jié)果

2.1? 各組HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)水平比較

四組IRAK-1蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，除了陰性對(duì)照組與C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、圖1。

3? 討論

miRNA是一類非編碼的小RNA分子，在人體的生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞功能及細(xì)胞生存周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。miRNA穩(wěn)定的存在于機(jī)體細(xì)胞中、組織液中以及血漿中，能夠調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，在病理生理情況下，細(xì)胞中的miRNA因消耗會(huì)表達(dá)減少，也會(huì)因細(xì)胞凋亡等機(jī)制釋放如血漿[8-9]，通過(guò)對(duì)miRNA功能的研究能夠明確闡述細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞功能異常的機(jī)制。

miR-146a-5p是miRNA成員之一，研究表明在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中，其具有免疫調(diào)節(jié)的作用，發(fā)揮抑制炎癥的作用[10-11]。研究證實(shí)，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，其表達(dá)水平能夠發(fā)生顯著變化，通過(guò)分子研究表明，其在抗炎方面作用顯著，包括促進(jìn)炎癥修復(fù)，以及抑制慢性炎癥作用[12-13]。研究證實(shí)，高糖環(huán)境下機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性的低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)，炎癥反應(yīng)過(guò)程能夠加速線粒體的損傷并進(jìn)一步促進(jìn)胰島細(xì)胞的凋亡，同時(shí)減少胰島素分泌引起患者高血糖的發(fā)生。炎癥還能夠減少外周肌肉及脂肪組織對(duì)于糖的代謝及利用，使機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗[14]。還有實(shí)驗(yàn)在糖尿病模型小鼠的胰島細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，研究顯示高糖環(huán)境下小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)miR-146a-5p的表達(dá)水平顯著高于非糖尿病小鼠模型，進(jìn)一步證實(shí)了在炎癥刺激情況下，miR-146a-5p的過(guò)量表達(dá)是進(jìn)一步發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。

IRAK-1是一類炎癥反應(yīng)因子，具有放大和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的作用，人IRAK-1基因位于Xq28位點(diǎn)，在細(xì)胞炎癥免疫過(guò)程中通過(guò)激酶激活一系列炎癥因子，并且誘發(fā)下游炎癥因子產(chǎn)生瀑布式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥，影響細(xì)胞功能并產(chǎn)生組織損傷[16]。國(guó)外的研究顯示，在IRAK-1基因敲除小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除后小鼠膿毒血癥及腦髓炎這類炎癥反應(yīng)的發(fā)生率降低，進(jìn)一步證明小鼠體內(nèi)IRAK1因子降解是機(jī)體防止炎癥反應(yīng)過(guò)度表達(dá)的非常重要的防護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也檢測(cè)到其相關(guān)的炎癥因子表達(dá)降低，證明抑制IRAK-1表達(dá)能夠減緩細(xì)胞的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[17-18]。但miR-146a-5p是否對(duì)HepG2細(xì)胞中的IRAK-1蛋白表達(dá)產(chǎn)生一定的抑制作用未見(jiàn)報(bào)道；在P.gLPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)是否IRAK-1表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化未見(jiàn)報(bào)道；在P.gLPS所誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-146a-5p是否仍能抑制IRAK-1蛋白表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示miR-146a-5p能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞中IRAK-1蛋白表達(dá)；P.gLPS刺激能夠顯著增加HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)；在P.gLPS刺激HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)中，miR-146a-5p能夠通過(guò)抑制細(xì)胞IRAK-1蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制炎癥的作用。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在肝HepG2細(xì)胞中，miR-146a-5p通過(guò)抑制IRAK-1蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制炎癥的作用，證實(shí)其在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)為miR-146a-5p相關(guān)細(xì)胞中的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

4? 參考文獻(xiàn)

[1] Melin B，Cherqui G，Blivet M J，et al.Dual effect of meformin in cultured and prevention of insulin induced resistance[J].Metabolism，1990，39：1089

[2] Park H，Hwang YH，Kim DG，et al.Hepatoprotective effect of herb formula KIOM2012H against nonalcoholic fatty liver disease[J].Nutrients，2015，7（4）：2440-2455.

[3] Kamble P，Litvinov D， Aluganti Narasimhulu C，et al.Aspirin may influence cellular energy status[J].Eur J Pharmacol，2015，749：12-19.

[4] Balasubramanyam M，Aravind S，Gokulakrishnan K，et al. Impaired miR-146a-5p expression links subclinical inflammation and insulin resistance in type 2 diabetes[J]. Mol and Cell Biochem，2011，351（1-2）：197-205.

[5] Chen X，Liang H，Zhang J，et al.Horizontal transfer of microRNAs：Molecular mechanisms and clinical applications[J]. Protein Cell，2012，3（1）： 28-37.

[6] Joh EH，Jeong JJ，Kim DH.Kalopanaxsaponin B inhibits LPS-induced inflammation by inhibiting IRAK1 Kinase[J].Cell Immunol，2012，279（1）：103-108.

[7] Yang WS， Jeong? D，Yi? YS，et al.Myrsine seguinii ethanolic extract and its active component quercetin inhibit macrophage activation and peritonitis induced by LPS by targeting to Syk/Src/IRAK-1[J].Jethnopharmacol，2014，151（3）：1165-1174.

[8] Mortuza R，F(xiàn)eng B，Chakrabarti S.miR-195 regulates SIRT1-mediated changes in diabetic retinopathy[J]. Diabetologia，2014，57（5）： 1037-1046.

[9] Tabuchi T，Satoh M，Itoh T，et al.MicroRNA-34a regulates the longevity-associated protein SIRT1 in coronary artery disease： Effect of statins on SIRT1 and microRNA-34a expression[J].Clin Sci（lond），2012，123（3）： 161-171.

[10] 楊柳，黨永康，烏蘭，等.miR-146a-5p靶向IRAK-1調(diào)控DVT患者內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖及炎癥[J].重慶醫(yī)學(xué)，2021，50（17）：2906-2911.

[11] 陳芳榮，吳棟才，陳小菊.miR-146a-5p抑制TRAF6/NF-кB信號(hào)通路影響滋養(yǎng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2021，27（6）：410-415.

[12] TaganovKD，BoldinMP，ChangKJ，et al.NF-kappa-B-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J]. Proc Nat Acad Sci，2006，103：12481-12486.

[13] Xie YF，Shu R，Jiang SY，et al.MicroRNA-146 inhibits pro-inflammatory cytokine secretion through IL-1 receptor-associated kinase 1in human gingival fibroblasts[J]. J Inflamm （Lond），2013，10（1）：20.

[14] Steer SA，Scar IM AL，Cham Bers KT，et al.Interleukin-1 stimulates beta-cell necrosis and release of the immunological adjuvant HMGB1[J]. PLoS Med，2006，3（2）： 17.

[15] Chen X，Liang H，Zhang J，et al.Horizontal transfer of microRNAs：Molecular mechanisms and clinical applications[J]. Protein Cell，2012，3（1）： 28-37.

[16] Janssens S，Beyaert R.Functional diversity and regulation of different interleukin-1 receptor-associated kinase （ IRAK） family members[J].Mol Cell，2003，11（2） ： 293-302.

[17] Deng C，Radu C，Diab A，et al.IL-1 receptor-associated kinase 1 regulates susceptibility to organ-specific autoimmunity[J]. Immunol，2003，170（6）：2833-2842.

[18] Berglund M，Thomas JA，F(xiàn)redin MF，et al.Gender dependent importance of IRAK-1 in dextran sulfate sodium induced colitis[J].Cell Immunol，2009，259（1）： 27-32.

[2022-12-26收稿]