中藥通過調控信號通路治療骨關節炎作用機制研究概述

唐賽清 寇久社 王東 張保平 阮珍 騫童

骨關節炎是一種以關節疼痛、腫脹、功能障礙等為主要癥狀的慢性關節退行性疾病,嚴重影響患者的日常工作和生活質量[1]。骨關節炎的發生發展是一個復雜的、多環節的過程,涉及多條信號通路及多個靶點。近些年來,中藥通過調控信號通路治療骨關節炎逐漸成為研究熱點。已有大量研究證實中藥在骨關節炎治療上療效顯著,其機制可能是通過對核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、Wnt、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等多種信號通路的關鍵蛋白及上下游靶點的調控來影響炎癥反應、關節軟骨細胞及細胞外基質的破壞及降解等骨關節炎發生發展的多個環節,從而延緩骨關節炎的進展,起到治療作用。本文通過查閱近年來相關文獻,基于上述信號通路對中藥治療骨關節炎的作用機制進行歸納與總結,以期為骨關節炎的中醫干預及中藥的新藥研發提供理論參考。

1 影響NF-κB信號通路

NF-κB是一種普遍存在于各種細胞的轉錄因子,在未受到刺激信號的影響下,它與抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)形成復合物存在于細胞質中。而一旦受到刺激后,IκB激酶(IκB kinase,IKK)被激活引起IκB蛋白發生磷酸化及降解,NF-κB復合物得以釋放,從細胞質中轉移至細胞核內,與DNA結合位點相結合,引起促進骨關節炎的相應基因表達,從而在骨關節炎的發生和發展中發揮重要作用[2-3]。研究表明,在骨關節炎的發生發展中,NF-κB信號通路受到多種刺激得以激活,導致軟骨細胞中炎癥相關因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、誘導型一氧化氮合酶、前列腺素E2等,以及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTs)等基質降解酶的表達增加,從而加重炎癥反應及關節軟骨的降解和破壞[4]。

連翹苷元是從連翹果實中提取出來的一種有效成分單體,具有抗炎、抗感染、抗氧化應激、免疫功能調節等多種藥理作用[5]。胡芯源等[6]研究發現,連翹苷元可上調軟骨組織聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達水平,下調MMP-13的表達水平以及抑制IL-6、IL-17、TNF-α、單核細胞趨化蛋白1等促炎細胞因子的表達,減輕炎癥反應。同時,連翹苷元還可下調軟骨組織中半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3和Caspase-9水平,及提高凋亡抑制基因B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)與促凋亡基因Bcl-2相關X(Bcl-2 associated X,Bax)的比值,從而抑制軟骨細胞凋亡。此外,連翹苷元還可抑制軟骨組織中Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR-4)及其下游分子髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、NF-κB p65蛋白的表達及活化,表明連翹苷元可能是通過抑制TLR-4/MyD88介導的NF-κB信號通路,起到維持軟骨代謝穩態、減輕炎癥反應、降低關節軟骨破壞等作用。

青藤堿為中藥青風藤的主要活性成分,具有鎮痛、抗炎、免疫抑制等作用[7],在治療骨性關節炎上取得了比較理想的療效。黃小魯等[8]發現青藤堿抑制可能通過抑制NF-κB p65的核轉位及NF-κB的DNA結合活性,從而抑制NF-κB信號通路介導的炎性反應。Wu等[9]在軟骨細胞實驗發現,不同濃度的青藤堿干預后核內p-NF-κB p65水平明顯降低,且軟骨細胞中p-IκBα的表達也顯著下降,并呈劑量相關性。這些結果指出青藤堿可通過抑制軟骨細胞NF-κB信號通路的激活從而抑制炎癥反應,起到治療骨關節炎的作用。

芍藥苷是從常用中藥白芍中提取出來的糖苷類化合物,具有鎮痛抗炎、免疫功能調節、神經保護、抗腫瘤等多種藥理作用[10]。陳譜等[11]通過細胞實驗發現,芍藥苷干預后IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子和MMP-13、ADAMT-5等基質降解酶的表達量明顯下降且呈濃度依賴性,這與芍藥苷既能明顯下調軟骨細胞中NF-κB p65、IKK的表達水平,又能上調IκB的表達有關。提示芍藥苷可能是通過抑制NF-κB信號通路,減輕炎癥反應及軟骨降解來起到治療骨關節炎的作用。

由上可知,中醫藥可能通過阻礙NF-κB信號通路的激活以抑制眾多炎性因子及基質降解酶的表達,從而減輕炎癥反應、抑制軟骨降解以達到治療骨關節炎的目的。此外,NF-κB信號通路是經典的炎癥信號通路,受到多種信號通路及上下游因子的調控,但目前的研究缺少對多通路間相互作用的綜合考量與進一步驗證,這也許是今后研究的方向。

2 影響Wnt信號通路

Wnt信號通路包括Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)經典信號通路和Wnt/平面細胞極化(planar cell polarity,PCP)、Wnt/Ca2+等非經典信號通路。當經典Wnt信號通路被激活時,Wnt蛋白可與卷曲蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6結合而激活散亂蛋白,使得軸蛋白、糖原合酶激酶-3β、腺瘤性結腸息肉病蛋白等組成的復合物發生裂解,進而導致β-catenin在細胞質中積累,并向細胞核內轉移。核內游離的β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子結合后可對下游靶基因的表達進行調控[12-13]。已有研究證明:β-catenin的過表達可促進多種基質降解酶的分泌,加重關節軟骨的破壞[14]。Wnt/β-catenin經典信號通路參與調控細胞凋亡、軟骨分化及骨贅形成等過程,與骨關節炎的發生和發展有著密切的聯系[15]。

2.1 單味中藥有效成分對Wnt信號通路的調控作用

姜黃素是傳統中藥姜黃的主要活性成分,提取于姜科植物姜黃的根和莖。它主要的藥理作用有抗炎鎮痛、抗氧化、腎臟及心臟保護等,且療效確切,安全性高[16]。舒子震[17]研究發現膝骨關節炎大鼠軟骨Mankin’s評分及β-catenin蛋白的表達量與空白組相比明顯增加且兩者成正相關,證明β-catenin蛋白參與了骨關節炎的發生與發展。而使用姜黃素干預后,軟骨Mankin’s評分及β-catenin蛋白的表達量明顯下降,提示姜黃素可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白的表達,從而減少軟骨細胞的破壞和細胞外基質的降解,起到治療骨關節炎的作用。

2.2 中藥復方對Wnt信號通路的調控作用

七厘散是一種傳統的中成藥制劑,出自于清代作家謝元慶的《良方集腋》,主要由血竭、朱砂、紅花、麝香、沒藥、當歸等多種中藥組成,具有活血化瘀、止血鎮痛等功效[18]。已有研究證明,成骨調節基因Runx2在成骨細胞分化、軟骨細胞成熟分化等過程中發揮著重要的調控作用[19]。Runx2是Wnt/β-catenin信號通路的一個下游作用靶點,當Wnt/β-catenin信號通路受到促成骨因子的刺激時,Runx2會被激活并調控骨鈣素、osterix等骨相關蛋白的表達,從而在成骨分化過程中起到重要調控作用[20]。宋寒冰等[21]在七厘散治療膝骨關節炎兔模型實驗中發現軟骨的病變情況顯著改善,骨膜間質干細胞的增殖程度明顯增加,且成骨相關基因Runx2、骨鈣素、β-catenin及Wnt4a的表達水平顯著提高,說明七厘散可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路,上調成骨相關基因Runx2、骨鈣素的表達,從而促進骨膜間質干細胞的增殖和成骨細胞分化,起到改善關節軟骨破壞的作用。

芍藥舒筋片是一種主要由白芍、牡蠣、秦艽、甘草等多種藥材制成的中成藥制劑,具有抗炎止痛、舒筋通絡、軟骨保護的作用,在治療骨關節炎上取得確切的療效[22-23]。徐海濤等[24]研究發現,與對照組相比,芍藥舒筋片組軟骨細胞的增殖速率和miRNA-140的表達明顯增加,且Wnt-3a、β-catenin、糖原合酶激酶-3β miRNA和蛋白的表達水平明顯降低。這些結果提示,芍藥舒筋片可提高軟骨細胞的增殖速率,且能夠上調miRNA-140表達水平并抑制Wnt/β-catenin信號通路,起到延緩關節軟骨病變的作用。

上述研究提示Wnt/β-catenin信號通路在骨關節炎的發生發展中起著雙重作用,過度激活或抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性都不利于骨關節炎的治療。因此,如何做到精準調控Wnt/β-catenin信號通路值得思考與深入研究。

3 影響MAPK信號通路

MAPK是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要包括p38MAPK、細胞外調節激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等亞型。在受到炎性因子、生長因子、激素等細胞外刺激時,MAPK信號通路通過MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK這三層激酶逐級激活后進入細胞核,進而對相應的基因進行調控,在炎癥反應、細胞增殖分化、應激等過程中發揮著重要作用[25-26]。已有研究證明,MAPK信號通路參與了骨關節炎的發生和發展[27]。p38MAPK可被IL-1β等炎性因子激活,進而誘導更多炎癥介質和基質降解酶的產生[28]。JNK被激活后可促進基質金屬蛋白酶和TNF-α、IL-1等炎性因子的表達[26]。ENK信號通路被抑制劑阻斷后,可減少軟骨細胞中炎性因子和基質金屬蛋白酶的分泌[29]。

3.1 單味中藥有效成分對MAPK信號通路的調控作用

野黃芩苷是一種從中草藥燈盞花素中提取出來的黃酮類化合物,在糖尿病、腎損傷、心腦血管等疾病的治療上取得一定的療效[30]。Liu等[13]的體外實驗發現,野黃芩苷處理組軟骨細胞MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5、P38及p-P38的表達明顯下降,聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的表達明顯增加。同時,體內實驗發現野黃芩苷可減輕軟骨的病變程度,明顯降低關節組織p-P38的含量,這與體外實驗的結果一致。這些結果指出,野黃芩苷可能通過抑制MAPK信號通路起到延緩軟骨破壞的作用。

3.2 中藥復方對MAPK信號通路的調控作用

烏頭注射液主要是由烏頭類中藥材中提取出來的烏頭堿制作而成,具有抗癌、止痛、軟骨保護、提高免疫力等藥理作用[31]。劉陸[32]發現烏頭注射液可明顯減輕關節軟骨的破壞,抑制軟骨細胞JNK的表達,提示烏頭注射液可能是通過抑制MAPK/JNK信號通路,減少關節軟骨的破壞,從而發揮其對骨關節炎的治療作用。

補腎益肝活血方是一種主要由丹參、骨碎補、懷牛膝、沒藥等組成的中藥復方,有補腎益肝、消腫化瘀、止痛等功效[33]。許駿等[34]體外實驗發現,補腎益肝活血方能改善關節軟骨細胞的退化,抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達,且明顯下調軟骨細胞ERK和p38MAPK的表達,說明補腎益肝活血方可能是通過抑制ERK和p38MAPK信號通路而減輕軟骨破壞,起到治療骨關節炎的作用。

以上研究表明MAPK信號通路,包括p38MAPK、ERK、JNK等,被激活后可直接促進骨關節炎的發生與發展,而中藥干預后能抑制MAPK信號通路而減輕關節軟骨的破壞,延緩骨關節炎的進展。但上述研究只對通路上的關鍵蛋白進行了驗證,缺乏對通路上其它相關蛋白的研究。在后期研究中,建議完善對該通路其他蛋白的檢測,這有利于尋找出中藥干預的最佳靶點。

4 影響TGF-β信號通路

TGF-β是一種多功能細胞因子,在軟骨細胞增殖、分化和細胞外基質的合成等過程中發揮了重要作用[35]。在TGF-β信號通路中,TGF-β首先與高親和力的TGF-β II型受體結合形成二聚體,再與TGF-β I型受體結合形成復合物并激活TGF-β I型受體,激活的TGF-β I型受體使細胞內的受體調節型Smad(recept-Smad,R-Smad)發生磷酸化,最后被激活的R-Smad與Smad4結合并把信號傳導到細胞核,進而調控相應基因的表達[36]。激活素受體樣激酶(activin receptor-like kinase,ALK)1和ALK5為TGF-β I型受體的兩種亞型,其中ALK1負責激活下游分子Smad2和Smad3,而ALK5負責激活Smad1、Smad5、Smad8[37]。研究表明,TGF-β/Smad2,3信號通路在關節軟骨的穩態維持中發揮了重要的作用,而TGF-β/Smad1,5,8信號通路參與誘導軟骨細胞的終末分化[38]。

4.1 單味中藥對TGF-β信號通路的調控作用

鹿茸是從雄性梅花鹿或馬鹿頭上采收而來的幼角,具有延緩軟骨退化、抗炎、抗癌、護肝等多種藥理作用[39]。孫志濤[40]用鹿茸治療骨關節炎大鼠時發現軟骨組織破壞減輕,且關節軟骨中TGF-β I型、II型受體及TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表達量明顯增加,指出鹿茸可能通過促進TGF-β/Smad通路的信號轉導,起到促進軟骨形成、延緩軟骨破壞而治療骨關節炎的作用。

4.2 中藥復方對TGF-β信號通路的調控作用

右歸丸具有軟骨保護、內分泌調節、腎功能保護等藥理作用,在臨床上常用于治療骨關節炎、甲減、腎功能不全等疾病[41]。Zhang等[42]發現右歸丸可下調軟骨中MMP-13的表達,而上調p-Smad2的表達,明顯降低關節軟骨的破壞程度,提示右歸丸可能是通過激活TGF-β/Smad通路起到減輕軟骨細胞外基質的破壞的作用。此外,通過小鼠TGF-β RII基因敲除實驗發現,基因敲除組小鼠軟骨中MMP-13的水平明顯升高且p-Smad2的表達明顯下降,而用右歸丸干預后并沒有得到改善,進一步證明了右歸丸可能通過激活TGF-β/Smad通路起到保護軟骨的作用。

4.3 其他中醫治療方法對TGF-β信號通路的調控作用

針刀是由中醫傳統療法針刺與現代外科手術兩者結合改良形成的一種微創手術,它具有松解肌肉、韌帶等軟組織粘連的作用,在膝骨關節炎的治療上具有確切的療效[43]。楊郁鵬等[44]發現針刀能使骨關節炎兔血清中TGF-β1的表達量顯著提高,p-Smad2和p-Smad3的表達量顯著下降,證實針刀可能通過激活TGF-β/Smad信號通路來達到治療的骨關節炎的目的。

以上研究提示中藥不僅可以通過促進TGF-β/Smad信號通路關鍵蛋白的表達,還可對其關鍵分子的受體進行調控,進而減輕軟骨細胞及細胞外基質的破壞而改善骨關節炎,這提示今后的研究還可以靶點蛋白的受體為切入點,不斷豐富與完善中藥治療骨關節炎的機制。

5 小結與展望

隨著人口老齡化趨勢的不斷顯現,骨關節炎的發病率在逐年升高,提高治療效果及改善患者的生活質量是當務之急,醫者應該予以足夠的重視。骨關節炎的病因與發病機制十分復雜,多種信號通路參與了骨關節炎的發生與發展,涉及炎癥反應、軟骨細胞的破壞及細胞外基質的降解等。因此,對信號通路的調控在骨關節炎的治療中尤為重要。此外,各信號通路間存在著緊密的內在聯系,僅通過對某一信號通路的調控治療骨關節炎的療效欠佳,如何利用信號通路間的相互作用為骨關節炎提供更有效的治療是未來研究的方向。

中醫藥有著悠久的歷史,并具有安全性高、副作用少等優點,在骨關節炎的治療上發揮了明顯的優勢且具有廣闊的前景。中藥可通過對多種信號通路的調控進而達到治療骨關節炎的目的,但根據目前的研究來看,中藥治療骨關節炎信號通路方面的機制研究還不夠深入,仍缺乏對中藥治療骨關節炎的具體效應成分及精準干預靶點的探究。因此,中藥治療骨關節炎的具體作用靶點及中醫藥新藥的研發是今后研究的重點和方向。中藥和中藥復方因成分之復雜,作用靶點之多,很難闡明發揮治療作用的是單一成分還是多成分,后期可以利用組學等先進技術進行測序整合分析,為中藥治療骨關節炎提供更多數據支撐。此外,目前的研究大多還在基礎實驗階段,到廣泛應用于臨床還有一定的距離。而且,中藥的療效和副作用的評估手段還不夠完善,這需要開展更多樣本和多中心的隨機對照實驗。期望隨著研究的不斷深入,充分發掘中藥治療骨關節炎的潛在優勢,讓更多的患者從中受益。