從細胞凋亡角度探討針刺干預蛛網膜下腔出血認知障礙的機制之研究進展

熊康 張美玲 王禎芝 方永軍 胡珍淵 周鋒

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指顱內血管破裂,血液流入蛛網膜下腔的一種重型腦血管疾病。近期研究指出SAH和SAH術后常見認知功能障礙(cognitive impairment, CI),即使其他功能恢復良好的患者也常受此困擾,CI嚴重影響了生活質量、工作參與度與社會活動,不容忽視[1]。有研究證實SAH之后,海馬、腦血管等組織發生了細胞異常凋亡情況[2-3]。亦有研究發現通過抑制細胞異常凋亡可以緩解SAH所致的CI[4]。由此可知細胞過度凋亡參與了SAH CI發生發展過程,為SAH CI的重要原因,并提示通過對細胞異常凋亡進行調控對于防治該病證具有重要意義。針刺能促進腦功能恢復,在腦卒中后遺癥的防治方面有一定優勢。本文從細胞凋亡相關通路角度來探討針刺干預SAH CI作用機理,以期開拓基礎研究思路,提升相關診療效果。

1 細胞異常凋亡與SAH CI的發生發展密切相關

SAH后,腦部微環境改變與微循環障礙會致使細胞中的線粒體、內質網等亞細胞器出現損害[5]。線粒體是細胞內的“動力車間”與能量轉化、三羧酸循環、鈣離子存儲等密切相關,其在細胞凋亡中有著重要的作用。而持續或過度的內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)也可誘導細胞凋亡[6]。還有研究表明,SAH后腦血管組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表達水平升高[7],TNF-α可誘發炎癥反應,還可作為細胞外死亡配體與細胞表面相應的死亡受體結合,在細胞凋亡中亦扮演著重要角色。研究表明SAH所引發的細胞過度凋亡可能在SAH CI的發生發展中起重要作用[8]。一些信號通路也會直接或間接影響細胞凋亡相關因子,進而參與調控細胞凋亡過程。其中Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉導和轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號軸等與SAH CI發生發展過程中細胞凋亡有著緊密聯系[9-10]。因此,細胞過度凋亡與SAH CI的發生發展密切相關,是SAH CI的緊要原因,這為防治SAH CI提供了線索。調控細胞凋亡能減緩腦組織損傷,或許可能達成有效治療SAH CI的目的,是良性干預SAH CI的重要路徑。

2 針刺調控線粒體凋亡通路研究進展

2.1線粒體通過多種途徑影響細胞凋亡

線粒體膜通透性發生改變后,致使線粒體向細胞質釋放一些蛋白,其中線粒體釋放的細胞色素c(Cytochrome-c, Cyt-c)在細胞質中可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)級聯反應,引起細胞凋亡。部分研究發現SAH后腦組織中抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)表達水平降低,而促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bcl2-associated X,Bax)以及Caspase-3的表達水平升高[11-12],這提示總體上是促進了Cyt-c的釋放。Cyt-c釋放到細胞質溶質中后,會與凋亡蛋白酶激活因子-1以及Procaspase-9形成復合物,這種復合物會激活下游的Caspase-3等效應分子,致使細胞凋亡[13]。而線粒體釋放出的這些蛋白中,除了Cyt-c之外,還有凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF),且其可通過非Caspase依賴細胞凋亡通路參與凋亡過程,亦能誘發細胞凋亡[14]。蔣崇貴等[15]研究發現SAH后應用Caspase抑制劑的實驗組大鼠海馬區AIF表達水平顯著升高,提出當Caspase依賴通路被抑制時,SAH后早期細胞凋亡或許主要是由AIF途徑介導的觀點。所以Caspase依賴通路與非Caspase依賴通路均參與介導了SAH CI發生發展過程中的細胞凋亡,且二者間存在相互聯系。

2.2針刺對線粒體源凋亡信號的控制作用

針刺能調節Bcl-2、Bax等的表達,控制Cyt-c和AIF從線粒體的釋放以及后續凋亡進程,而減輕細胞過度凋亡程度。陳英華等[16]研究發現針刺血管性癡呆大鼠風池、四神聰,可以增加大鼠海馬區Bcl-2表達,減少Bax表達,起到腦保護作用。SAH后由于腦部微循環障礙,導致腦血流量減少,腦功能損害加劇。針刺治療可使經絡疏通,氣血調達,有利于消除血腫,減輕血管痙攣,調節腦灌注量,改善血液循環,韓佳煒等[17-18]在針刺對腦出血模型大鼠急性期血腫周圍腦組織細胞凋亡的影響及相關機制的研究中發現,針刺人中和內關可顯著改善腦出血模型大鼠神經功能缺損體征,減輕腦損傷,并且穴位組療效顯著優于非穴位組,相較于非穴位組大鼠,針刺水溝和內關的穴位組大鼠腦組織中Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表達水平顯著降低,認為針刺人中和內關對腦出血的干預作用機制可能與調節Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3等表達,抑制腦出血后神經細胞過度凋亡有關,并提示穴位是影響針刺效應的重要因素之一。

因為AIF可通過非Caspase依賴途徑,亦能介導凋亡發生,所以單純靶向Caspase通路,或許并不能有效控制SAH CI發生發展過程中的細胞凋亡。近期有研究探討針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血大鼠腦組織中AIF表達的影響,發現針刺可改善急性期腦出血大鼠神經功能評分,有效抑制神經細胞異常凋亡,降低腦出血后血腫周圍腦組織中AIF的表達水平[19]。該結果可為針灸治療SAH CI提供新思路,由此也可見無論對于Caspase依賴凋亡通路還是非Caspase依賴凋亡通路,針刺均能夠發揮調控效應。且從一定程度上亦反映了針刺療法具有多靶點、多途徑、多水平的整體調節特點。

而鮮有文獻研究聯合Caspase依賴途徑與非Caspase依賴途徑,探析針刺的干預效應,故深挖針刺療法對二者的整合作用,頗具研究潛力。

3 針刺調控內質網凋亡通路研究進展

3.1內質網應激太過促使細胞凋亡

ERS可引發未折疊蛋白反應,之后啟動跨膜蛋白激酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)介導的助細胞存活程序,而持續或劇烈的ERS則會激活與增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)、Caspase-12、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK)等相關的促細胞凋亡途徑,且PERK、IRE1、ATF6等亦在ERS介導的促細胞凋亡通路中扮演重要角色[20-21]。相關研究顯示,SAH后,腦組織中p-PERK的表達上調,且PERK之抑制可能通過Akt相關的抗凋亡途徑抑制SAH后的細胞凋亡,減輕腦損傷[22]。這表明控制ERS,有益于減緩細胞凋亡情況,助力SAH CI的防治。

3.2針刺對內質網應激的制約作用

龔麗等[23]研究發現,針刺療法可以對腦缺血再灌注受損腦組織起修復與保護作用,提高患鼠學習記憶等能力,蛋白免疫印跡法檢測結果提示其機制可能與降低PERK、CHOP、Bax表達水平,提高Bcl-2與p-Akt表達水平,調控ERS相關的細胞凋亡通路有關,而且針刺療法聯合康復訓練的治療效果更佳。葡萄糖調節蛋白78是重要的ERS效應分子,其作為ERS標志物,可反映內質網功能狀態。毛旭等[24]進行了針刺對阿爾茨海默病大鼠海馬區神經元細胞內質網應激及凋亡的影響研究,發現針刺能夠調控葡萄糖調節蛋白78、Caspase-12等分子的表達,降低細胞凋亡水平,表明針刺可控制ERS,調節內質網凋亡通路,有益于減緩認知障礙。至此可知針刺能夠制約過度ERS,促進并維護亞細胞器穩態。

前已述及SAH后,多細胞器的結構與功能均發生改變,且與細胞凋亡有著緊密聯系,因而值得深入研究針刺治療SAH CI過程中,其對內質網、線粒體等亞細胞器良性干預的機制。

4 針刺調控死亡受體凋亡通路研究進展

4.1死亡配體受體相合引發細胞凋亡

細胞外死亡配體與細胞表面相應的死亡受體結合可引發一系列生物效應。TNF-α是一類多向性細胞因子,作為死亡配體與其受體結合后,能促使Caspase-8、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、鞘磷脂酶等的激活,可引致細胞凋亡[25]。這些因子也會互相作用,互相影響,如鞘磷脂酶有利于NF-κB的活化,NF-κB又可以促進TNF-α的基因轉錄,并且影響TNF-α的作用,NF-κB也能夠調節Caspase家族、Bcl-2家族等的表達,對于細胞凋亡,NF-κB可能具有雙向調節作用[26-27]。研究顯示SAH患鼠腦組織中的TNF-α、Bcl-2、Caspase-3等分子水平發生顯著改變,并伴隨有神經細胞過度凋亡情況,臨床也發現SAH患者腦脊液中白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、TNF-α的水平明顯升高,并與SAH的預后息息相關[28]。因此,調節TNF-α等的表達可能有益于防治SAH CI。

4.2針刺對死亡受體凋亡通路的調節作用

目前針灸療法在調控死亡受體凋亡通路方面的研究已取得一定進展。有研究通過制造腦缺血再灌注損傷模型,治療予以電針百會和大椎,運用免疫組化、蛋白免疫印跡等方法觀測大鼠皮質半暗區目的蛋白表達,發現電針能調節NF-κB和TNF-α的表達,有效減輕腦部炎癥反應,同時顯著抑制皮質半暗帶TNF-α介導的相關細胞凋亡通路表達,減少神經細胞損失[29]。此外,楊超等[30]研究發現血管性癡呆大鼠模型血清中TNF-α含量增高,而針刺血管性癡呆大鼠百會、四神聰、大椎,可顯著減少患鼠TNF-α的釋放,改善神經精神癥狀,助力腦功能恢復。故可推測針刺防治血管性認知障礙的機制可能與調控TNF-α介導的炎癥反應和細胞凋亡有關。

結合前述還可看出NF-κB、IRE1、ATF6等可能對凋亡具有雙面效應,對于雙面因子,因其在凋亡中的作用模式較復雜,故針刺在調控細胞凋亡過程中,對分子之表達以及其具體所顯作用的影響尚需進一步研究,可以豐富針刺作用的雙向性在分子生物學方面的涵義。

5 針刺調控相關信號通路研究進展

龐金偉等[31]研究發現SAH之后,出現了JAK2/STAT3信號通路活化,以及過度凋亡情況,而抑制JAK2/STAT3信號通路后,IL-1β、IL-6、TNF-α等因子表達水平降低,細胞異常凋亡情況亦顯著緩解,提示SAH后JAK2/STAT3信號通路參與了早期腦損傷的病理過程。面對腦部微環境惡化,針刺能夠影響信號分子表達,有益于機體穩態的促進與維持,韓德雄等[32]電針腦缺血再灌注模型大鼠百會穴與內關穴,采用TUNEL法檢測神經元凋亡情況,RT-PCR技術檢測JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達情況,發現電針可以抑制腦損傷過程中的神經元過度凋亡,發揮保護腦組織,改善神經功能的作用,其機制與針刺對JAK2/STAT3通路進行調控密切相關。

包括ERK1/2、JNK等在內的MAPK信號通路參與調節細胞的增殖、分化、凋亡等多種重要的生理病理活動。其中ERK信號通路可能通過影響p53的磷酸化,參與調節SAH后海馬區神經元凋亡,而通過改變ERK通路活性,可減少神經細胞凋亡,并減輕SAH CI[33]。還有研究發現在SAH后腦損傷過程中,JNK信號通路和TNF-α可能會形成JNK-TNF-α反饋循環途徑,JNK可能誘導TNF-α的表達,而TNF-α又會增強JNK的表達,從而誘導大腦皮層和海馬區的細胞凋亡[34]。亦有研究顯示SAH之后,海馬區有異常凋亡情況,p-JNK、p-c-Jun及Caspase-3表達均上調,通過調控JNK/c-Jun信號通路可以抑制細胞凋亡,并且減輕SAH早期腦損傷[35-36]。林亞平等[37]研究發現針刺及亞低溫均可以改善神經功能缺損,抑制細胞凋亡,對腦組織起保護作用,免疫組化、蛋白免疫印跡技術檢測結果示其機制可能與調控ERK通路及改變Bcl-2表達水平和Bax表達水平有關,且針刺聯合亞低溫的療效優于針刺或亞低溫單獨運用。朱雯等[38]取血管性癡呆大鼠百會、足三里進行針刺,結果顯示針刺能夠調節大鼠皮質中p-JNK表達,抑制神經元凋亡。因此,針刺可能通過影響凋亡相關分子間的反饋途徑,來逆轉加劇凋亡的惡性循環。

研究發現SAH后受損腦組織中成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表達水平上升[39]。相關研究表明bFGF能夠激活PI3K/Akt通路而促進細胞生存[40]。有研究顯示SAH后海馬和額葉皮質中Akt與ERK的磷酸化水平會有變動,提高其表達可以抑制細胞過度凋亡,減緩SAH CI,而且PI3K/Akt的保護作用部分是通過調節ERK通路而實現的[41]。還有學者認為SAH后激活了Akt信號通路,但該通路的活性不能維持以保護神經元細胞[42]。同時由于SAH損傷效應,bFGF的相對低表達,亦不能活化足夠的PI3K等通路去啟動有效的抗凋亡過程,使細胞修復能力不足,這就需要有效方法介導相關通路,從而起到對抗細胞過度凋亡,保護并修復神經元的作用。劉芳[43]進行了針刺治療血管性認知障礙的動物實驗研究,Morris水迷宮實驗結果提示,電針百會、神庭能夠顯著改善患鼠的認知功能,TUNEL檢測發現電針可以抑制患鼠神經細胞凋亡,實時熒光PCR和蛋白免疫印跡檢測結果顯示相較于模型組大鼠,電針組大鼠腦皮質組織中PI3K、p-Akt、Bcl-2表達顯著上調,Bax表達顯著降低。劉靜[44]研究發現頭針叢刺能夠調節PI3K/Akt信號轉導通路表達,減輕血管性癡呆大鼠神經元凋亡,從而減緩認知功能障礙,且頭針叢刺聯合運動訓練療效更佳。可見針刺療法治療血管性認知障礙,控制異常凋亡的機制與協調PI3K/Akt通路、MAPK通路、JAK/STAT等信號通路有關,并可結合其他療法以協同增效。

6 結語和展望

綜上所述,可見SAH引起的細胞異常凋亡是介導SAH CI發生發展的關鍵環節,且凋亡相關通路并非各自孤立,而是相互影響,相互溝通,顯現出錯綜相連,而又精致細密的分子網絡。CI是腦卒中的常見后遺癥,世界衛生組織已提出“認知障礙是嚴峻的全球公共衛生與社會照護挑戰”。而針對上述這些相關線索,開展多分子、多通路的實驗嘗試,可能會有利于針對SAH CI等疑難病癥的有效治療方法的發展。

關于SAH CI的治療一直是臨床難點,而目前,現代醫學對SAH CI尚缺乏療效確切的治療方法。SAH CI屬中醫“中風”“健忘”“呆病”等病證范疇。《傷寒論》云“其人喜忘者,必有蓄血”,點明了該類疾病之病機,于《靈樞》中有“瀉其有余,補其不足,陰陽平復,用針若此,疾于解惑”等針刺理法的相關記載。近些年來,也有研究證實針刺對蛋白分子有明確干預作用,且針刺在腦卒中后越早介入成效越好[45]。《素問》言“非其位則邪,當其位則正”,《類經》曰“氣之在人,和則為正氣,不和為邪氣”,《醫經秘旨》謂“治則為正氣,不治則為邪氣”。細胞凋亡本為維持內環境穩定的一種細胞死亡過程,屬正氣范疇,是機體正氣功能的重要體現[46]。若其太過或不及則為邪矣,屬于病理變化,會加重病理狀態,甚或引起新的病變發生。中醫針灸療法注重守中致和,由前述可見對于異常細胞凋亡,針刺能夠全面發揮良性調控效應,促使其向中正平和狀態轉化,可令其“改邪歸正”。

且觀上文可知SAH CI發生發展過程中,機體亦存在一定程度的調控凋亡等自身保護修復情況,然尚不足以扭轉SAH損傷態勢,故需和氣扶正。經絡即“氣路”,與生理功能和病理變化等緊密相關,主管機體的生老病死,是生命自備的溝通上下內外、聯系五臟六腑的調節控制系統,作用于經絡腧穴的針刺療法有調和陰陽、理氣和血等功效,運用針刺療法可以借助機體自身的經絡系統,扶助機體自身的調節能力。從上述研究可推度針刺療法良性干預SAH CI的機制可能與其調控凋亡相關通路,抑制細胞過度凋亡有關,且針刺療法的療效受穴位、時間、刺激方法等因素影響,這些都值得深入探究,此將有助于豐滿針刺治療SAH CI相關機理,為臨床的及早與廣泛應用提供更多支持,對腦血管疾病的積極防治,有效解決認知障礙這一難題意義重大。