基于PI3K/AKT信號通路探討中醫藥干預糖尿病血管病變的研究進展

劉彥彤 王郁金 蘇衍進 譚從娥 王相東 邢文文

糖尿病血管病變(diabetic angiopathies，DA)是糖尿病最常見且嚴重并發癥之一。DA分為大血管病變和微血管病變，大血管以動脈內膜脂質沉著和平滑肌細胞增殖引起的內膜肥厚和狹窄為主要特征，主要表現為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS),微血管病變以微循環障礙、微血管瘤形成以及微血管基底膜增厚為主要特征，主要表現為糖尿病潰瘍、糖尿病視網膜病變和糖尿病腎病等。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinsoitide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT/PKB)信號通路作為胰島素傳導信號的主要介導途徑之一[1]，其在細胞凋亡、增殖和血管異常的發病機制中起著重要作用[2]，并且可以提高胰島素敏感性、糖脂代謝，保護血管內皮作用[3]。而中醫藥在治療DA上有其優勢與特色。因此，本文概述AKT通路及有關靶蛋白的介導機制與中醫藥基于此的干預及學術意義，以期為中醫藥干預DA并發癥的臨床與科研提供更多思路。

1 中醫藥通過PI3K/AKT調節血管內皮

1.1 AKT下游靶蛋白調節血管內皮細胞功能

血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)具有調節血管通透性、維持血流和調節血管平滑肌細胞增殖等重要功能。VEC的凋亡增加平滑肌細胞的增殖和遷移、血液凝固以及白細胞向內皮細胞的浸潤，從而致內皮細胞功能障礙。在糖尿病狀態下多種代謝紊亂加重內皮功能障礙，這也是糖尿病及其血管并發癥發生的重要初始因素[3]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是內皮依賴性血管舒張的主要介質，具有舒張血管、抗凋亡、抗炎、抗血栓特性，對維持內皮舒張功能穩定起著決定性作用，能夠進一步干預AS的發展[4]。VEC不直接分泌NO，而是由調控內皮源性NO產生的關鍵酶內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化衍生生成[5]。

1.2 中醫藥激活PI3K/AKT催化eNOS合成NO

eNOS是AKT的下游靶蛋白，激活的PI3K/AKT可以直接磷酸化eNOS，從而促進NO產生，改善血管內皮功能并且修復血管內皮。謝春燕[6]發現血管內皮細胞實驗中高糖組濃度越高，NO分泌越少，使用大黃素干預后NO分泌明顯增多，在進一步的研究機制中發現，大黃素提高AKT的磷酸化水平，促進NO分泌。一些研究中得出，柚皮苷、黃芪多糖也可以通過AKT通路，促進NO合成[7-9]。魯雪麗[10]觀察到參附注射液通過AKT通路促進NO產生的同時，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量顯著降低，提示參附注射液通過AKT通路提高微循環灌注，減少氧化應激反應和心肌損傷。有研究表明，NO與活性氧(reactive oxygen species，ROS)相互限制活性，提高NO可減少ROS的產生，減少氧化應激損傷[11]。毛竹君等[12]觀察到運脾散結活血方組NO水平升高，白介素-6(interleukin-6, IL-6)顯著下降，提示激活AKT/eNOS通路減少炎癥，改善血管內皮損傷。

VEC功能障礙不僅是AS的早期事件，而且貫穿著整個AS的進程。通過AKT通路干預NO的恢復，也意味著VEC的功能逐步恢復，這對減少血管損傷、減少炎癥因子黏附，從而干預AS進程有著重要意義。最新研究表明，通過AKT/eNOS干預DA大血管病變仍然是研究重點，但趨向于與相關通路的交互反應，或通過miRNA下調目的基因的表達來更系統的研究AKT/eNOS對DA并發癥的影響[13-14]。

1.3 中醫藥激活PI3K/AKT調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

激活AKT通路可促進血管內皮細胞增殖與毛細血管的生成[15]。而微血管是肉芽組織生長必不可少的因素，可給瘡面提供重要的細胞因子，促進糖尿病潰瘍(diabetic ulcer，DU)的愈合[16]。賈湘隆等[17]在實驗中用回陽生肌膏外敷動物模型傷口時發現，實驗組瘡面早中期CD34、VEGF蛋白顯著上升，而后期趨平于對照組，在AKT抑制組中CD34與VEGF則顯著下降，提示激活的AKT有助于創面早期的修復。郭靜等[18]觀察到通賽脈片可以增加早期磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B，P-AKT)、eNOS、VEGF信號通路的表達，提示AKT通路的激活促進傷口愈合，其促進傷口愈合的機制可能集中在早期。VEGF是損傷后即刻傷口愈合的重要因素，并且可以加速非愈合性皮膚瘡面的愈合。上調VEGF，可以促進血管生成的早期階段即血管擴張、通透性、遷移和增殖。近年來，由于VEGF蛋白的重要性，大量研究通過AKT通路干預VEGF表達，或直接作用于VEGF，使之成為被治療的靶蛋白來干預傷口的愈合、缺血性中風等，并為臨床用藥、研發新藥提供指導[19-21]。

1.4 中醫藥抑制PI3K/AKT調控VEGF

人第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是PI3K/AKT信號通路關鍵的負調控因子，能夠抑制AKT的磷酸化。韓利平[22]、朱夢情等[23]發現黃地安消組大鼠p-AKT、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α)、VEGF水平明顯下降，假性激酶蛋白3(tribbles homolog 3/pseudokinase 3，TRIB3，TRB3)、PTEN蛋白水平顯著上升，提示抑制AKT可降低HIF-1α和VEGF的表達，其進一步機制為TRIB3、PTEN抑制AKT通路，阻斷PKB和酶活性的下游來調節內皮細胞VEGF信號通路和細胞反應，從而干預AS的進程。楊春寧等[24]通過三七總皂苷抑制CD34、VEGF、PI3K、AKT蛋白表達下降，抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移和內膜增生。高泓[25]使用參芪復方組抑制PI3K/AKT/eNOS表達，降低VEGF表達，抑制內皮細胞凋亡阻止動脈粥樣斑塊形成和病理性新生血管形成。有研究表明調節VEGF靶蛋白可干預AS的進程[26]。上述研究中，中醫藥通過抑制PI3K/AKT通路調節DA大血管病變減少VEGF表達來干預AS，與研究[6-10, 12]激活AKT磷酸化eNOS恢復VEC功能阻止AS進程機制不同，但是VEGF的產生是血管內高糖、缺氧環境的反應，抑制AKT則會加重血管內糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)的蓄積，形成惡性循環，而通過減少糖尿病血管內AGEs，改善炎癥才是解決問題根本答案。因其兩者所作用的靶蛋白不同，何種對糖尿病大血管病變更有臨床意義則需要進一步的研究。

楊敏[27]在實驗中觀察到右歸丸組VEGF、血管內皮細胞生長因子受體2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2)表達受到抑制，并減少二者結合，可進一步抑制PI3K、AKT的表達，達到抑制視網膜內皮細胞的增殖及遷移和內膜增生，致高糖缺氧下視網膜病理性新生血管生成減少。與研究通過上調VEGF不同，以臨床干預目的不同而進行調整，即DU則以激活為主，促進傷口愈合，而糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy，DR)則以抑制AKT減少VEGF表達產生病理性新生血管為主[17-18]。目前，國內外研究表明，VEGF與糖尿病視網膜病變的發病機制密切相關，通過中醫藥活性成分或miRNA調節不同病理改變的DR期間VEGF的表達，對控制DR的發展起著至關重要的作用[28-29]。

2 中醫藥通過PI3K/AKT調節代謝

2.1 AKT下游靶蛋白促進代謝，減少AGEs蓄積、氧化應激與炎癥

在持續高糖內環境下，AGEs增多，致使超氧化物增多，PI3K/AKT信號傳導受阻，eNOS活性下降，NO合成減少，血管始終處于慢性炎癥并形成惡性循環。而磷酸化的AKT可刺激葡萄糖轉運蛋白-4(glucose transporter-4，GLUT-4)的表達和易位，增加糖原合成，促進糖酵解，抑制糖異生，及抑制β細胞凋亡，增加β細胞增殖與生存，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗狀態[30-31]。并且，磷酸化的AKT通過抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)來降低糖原合酶的磷酸化并抑制關鍵糖異生酶-磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)的表達，最終促進糖原合成[32]。

2.2 中醫藥激活PI3K/AKT調節代謝

王景尚[33]在西洋參莖葉總皂苷組中發現p-AKT、p-GSK-3β(磷酸化GSK-3β)蛋白表達顯著增加，而腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血清可溶性細胞間粘附分子-1(serum soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1)、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(hemagglutinin like oxidized low density lipoprotein receptor 1，LOX-1)、AGEs含量顯著降低，在進一步的研究機制中發現，激活AKT/GSK-3β能調節代謝，減少AGEs，LOX-1的過表達及血管炎癥反應，從而干預血管內皮損傷。目前，有研究發現GSK-3β靶蛋白不僅參與糖代謝、炎癥，還參與細胞凋亡和氧化應激[34-35]。郭楊志等[36]觀察到白虎湯組PI3K、AKT蛋白、肝脂肪酸氧化基因mRNA升高，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)表達降低，提示白虎湯可通過改善糖脂代謝，減少炎癥因子，間接改善血管炎癥損傷。上述研究中相關炎癥因子指標有所下降，其原因為AKT通路激活緩解血管內代謝紊亂，改善內環境，減少炎癥因子表達的條件。姚燦坤等[37]在研究中發現PI3K、AKT、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)明顯升高，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-6、MDA顯著降低，提示冠心通絡方組激活AKT通路降糖、減少氧化應激損傷和炎癥反應。靳立英[38]在實驗中觀察到AGEs濃度越高，細胞活力越差，使用紅芪多糖后ROS、MDA含量明顯降低，SOD、PI3K含量明顯升高，提示紅芪多糖組通過AKT通路減少血管內氧化應激所致血管損傷。高糖環境下加重氧化應激反應，過量的ROS又會促進AGEs的積累，AGEs則又加劇DA并發癥的發展。有研究[39]觀察到AKT通路具有升高抗氧化酶的作用。這與目前DA并發癥與氧化應激損傷干預學說[40]方向一致，即抗氧化劑難以達到理想效果，通過干擾活性氧產生酶或提高抗氧化酶的含量來達到平衡，這種上調抗氧化防御系統，可能是糖尿病并發癥更具有前景的治療選擇。

3 中醫藥通過PI3K/AKT調節炎癥反應

3.1 抑制AKT可減輕血管內炎癥反應

核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路是炎癥反應主要介質，它可以調節多種炎癥細胞因子的表達，并且還是參與氧化應激表達的重要因子[41]。抑制NF-κB可以減輕TNF-α等誘導的內皮細胞炎癥[42]。抑制AKT活性可抑制NF-κB啟動子活性[43]。

3.2 中醫藥抑制PI3K/AKT調節炎癥反應

朱昌國等[44]發現小檗堿降低PI3K、AKT表達，上調P21表達，進一步研究其機制為抑制AKT、抑制促炎介質水平，上調P21抑制細胞增殖，干預AS的發展進程。抑制細胞增殖和減少長期炎癥并發癥的發生可能是治療糖尿病血管并發癥的重要方法。但與AKT調節代謝間接改善炎癥不同，其作用機制為抑制AKT活性。此兩者觀點不同，需要進一步研究。但是，最新研究表明，NF-κB在AS中起著重要作用，通過AKT通路靶向NF-κB或者直接靶向NF-κB依然是研究重點，并且有望成為DA大血管病變治療的潛在生物標志物和治療靶點[45-46]。

4 中醫藥通過PI3K/AKT調節細胞凋亡

4.1 激活AKT調節細胞凋亡

PI3K/AKT途徑在調節細胞存活中起著關鍵作用，通過磷酸化AKT下游多種蛋白調節細胞存活[47]。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl2-Associated X基因(BCL2-Associated X，Bax)是對立拮抗的調控基因，Bcl-2抑制凋亡，Bax發揮凋亡作用，而半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是凋亡過程中最關鍵的凋亡執行蛋白酶，其激活受到一系列信號轉導級聯的調控[48]。磷酸化的AKT調節Bcl家族和Caspase家族抑制細胞凋亡[49]。

4.2 中醫藥激活PI3K/AKT調節細胞凋亡

劉陽等[50]發現銀杏葉提取物組降低凋亡蛋白Caspase 3、Bax表達,調升抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制由IL-1β所誘導的內皮細胞凋亡，這與IL-1β刺激組結果相反，提示銀杏提取物能通過AKT通路保護細胞凋亡。吳洋[51]在AKT抑制組中發現，人參皂苷Rb1誘導LDH和CK的下降明顯被抑制，并且抑制了Bc1-2升高和降低Caspase-3的表達，驗證了人參皂苷Rb1的護心作用與AKT通路的激活有關，其進一步機制為NO分泌增多，改善微循環，減少心肌損傷灶，升高抗凋亡蛋白Bc1-2，降低促凋亡蛋白Caspase-3，減少心肌細胞凋亡。武單單等[52]觀察到丹皮酚組上調抗凋亡蛋白AKT、Bcl-2、Bcl-xl的表達，抑制促凋亡蛋白細胞外信號調節激酶1和2(extracellular signal regulated kinases 1 and 2，Erk1/2)、磷酸化細胞外信號調節激酶1和2(Phosphorylated Erk1/2，p-Erk1/2)、Bax、裂解半胱天冬酶3(cleaved-Caspase3)、細胞色素C(cytochrome c，Cytc)的表達，與吳洋發現相符，提示增加AKT表達可抑制心肌細胞凋亡。心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，一般不能增殖，因此避免心肌細胞的凋亡或者損傷，顯得非常重要，尤其是糖尿病患者。目前，有大量研究[53-54]以AKT通路的抗凋亡為線索，旨在尋找合適的新藥或更好的干預相關靶蛋白的方法，來減緩不可再生的心肌細胞凋亡。

王皎皎等[55]研究表明人參皂苷Rg3組降低Bad、Caspase-3、升高Bcl-2，使凋亡細胞比例降低，并降低VEGF、ICAM-1蛋白表達，改善視網膜組織損傷。使用AKT抑制劑后，指標呈相反增長，提示人參皂苷Rg3通過激活AKT通路抑制細胞凋亡。田麗珍等[56]發現大黃蟄蟲丸組PI3K、AKT含量升高,凋亡蛋白Caspase-9含量降低，提示大黃蟄蟲丸抑制AKT減少視網膜周細胞凋亡。周細胞的缺失可顯著促進VEGF信號傳導，而VEGF對細胞凋亡又有明顯的影響。因此，周細胞的凋亡被認為是DR的早期病變。目前，AKT通路中多種下游靶蛋白直接或間接參與調節周細胞的存活或驅動微血管的VEGF細胞因子信號，并且已被證明能有效預防疾病的進程和視力改善[57-58]。

5 討論

AKT通路發現至今30余年來的研究揭示了一個復雜的分子機制調節和功能的藍圖。但是，目前中醫藥基于AKT通路干預DA的研究主要仍然以相關性為主體，或相關靶蛋白與DA某個并發癥的研究，缺乏深入性的研究。而AKT通路的介導是一系列靶蛋白的級聯反應，并且與其他有關信號通路的交互反應。但現有研究仍然會給科研者不少啟示。首先，賈湘隆等[17]通過局部用藥外敷上調VEGF表達，在最小程度或不影響其他DA并發癥的前提下，改善局部瘡面愈合。這種局部用藥或許為一些DA并發癥的干預提供了更多可能。其次，吳洋[51]在實驗中AKT抑制劑的使用，才明確了人參皂苷Rb1的護心作用是基于AKT通路，而非其本身。而大多數中醫藥關于AKT干預DA中所納入AKT抑制劑的研究較少，只是研究者選取疾病與之關聯性靶蛋白，對中醫藥是否基于AKT通路及其機制的研究卻是未能較為清晰的闡述。再次，DA并發癥發病因素本身就是糖脂代謝紊亂，AKT通路介導障礙所致的胰島素抵抗加劇，本文綜述不少研究通過抑制整個AKT通路來調控下游靶蛋白減緩AS進程，而非直接作用于靶蛋白，盡管實驗中證明減緩AS進程有效，但未能驗證是否長期可行。目前，現代醫學通過基因手段調節靶蛋白，而中醫藥也有不少關于中醫藥活性成分或通過其天然骨架的衍生物直接作用于AKT通路下游靶蛋白的研究[59]，具有多靶點和雙向調節作用的優點，并且其具有重要的學術價值。

綜上，Akt通路參與血管生理和病理的發生和發展。Akt通路的藥物靶向性在治療DA及其并發癥方面具有潛在的應用價值。但對我們來說，探索Akt通路的使用是值得的。因此，國內外學者充分發揮中醫藥優勢，篩選有效的藥材和復方，這對中醫藥干預DA具有重要的學術價值。并且，DA諸多并發癥的發病機制復雜，需要從多個角度進行廣泛深入的研究，以豐富中醫藥干預DA的作用，并指導進一步的轉化研究和臨床試驗。本文尚且存在不足之處，因納入文獻有限，未能涵蓋AKT信號通路中一些其他關鍵靶蛋白，與其他關鍵DA并發癥，望后續能完整其綜述。