胱天蛋白酶募集域蛋白9介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究進(jìn)展

張智祿，何新雨，彭瑜，張鉦

1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人口老齡化的不斷加速，心血管疾病的發(fā)病率和病死率不斷增高，其中急性心肌梗死（AMI）因起病急且病情變化快成為患者死亡的主要原因。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療雖然可以有效恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，但AMI患者1年內(nèi)再發(fā)心肌梗死率為2.5%，早期再發(fā)心肌梗死患者1年病死率達(dá)53.5%［1］。AMI患者較差的預(yù)后與心肌缺血再灌注損傷（MIRI）密切相關(guān)，閉塞血管重新開(kāi)放的同時(shí)加劇了心肌細(xì)胞的代謝失調(diào)，導(dǎo)致缺血心肌細(xì)胞不可逆死亡的增加及梗死區(qū)擴(kuò)大，這被稱(chēng)為無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，目前尚無(wú)有效的治療方法［2］。MIRI的發(fā)生涉及多種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及自噬、鈣超載及氧化應(yīng)激等［3］。胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）主要表達(dá)于骨髓細(xì)胞，此外在巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞中也有表達(dá)［4］，其由定位于人類(lèi)9q34.3的基因編碼，包含2個(gè)功能區(qū)，即位于N端的CARD結(jié)構(gòu)域和位于C端的具有450個(gè)氨基酸的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，前者具有胱天蛋白酶募集功能，后者主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)寡聚化作用［5］。生理狀態(tài)下，CARD9在細(xì)胞內(nèi)與其他含有CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)哺乳動(dòng)物針對(duì)特定真菌、細(xì)菌和病毒的先天免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)［6-7］。但是在缺血、缺氧等病理狀態(tài)下，CARD9可被異常激活，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，從而引發(fā)炎癥性疾病或某些腫瘤的發(fā)生［8］。越來(lái)越多的研究顯示，CARD9可以在心血管疾病中調(diào)控p38 MAPK、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體及核因子κB（NF-κB）的激活［9］，而這些炎癥因子能夠通過(guò)介導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、凋亡及自噬的方式作用于MIRI的病理生理過(guò)程，參與MIRI的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)就CARD9介導(dǎo)MIRI的機(jī)制作一綜述，以期為MIRI的治療提供新思路。

1 CARD9通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

炎癥反應(yīng)是MIRI的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)MIRI發(fā)生時(shí)，固有免疫應(yīng)答立即被激活，造成過(guò)度的急性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、活性氧分泌及血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)一步加重心肌組織損傷［10］。

1.1 通過(guò)激活p38 MAPK調(diào)控心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)先天免疫反應(yīng)與MIRI具有一定的因果關(guān)系，CARD9作為先天免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)蛋白，能夠通過(guò)介導(dǎo)p38 MAPK激活調(diào)控促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生［11］。在肥胖小鼠模型中，小鼠心臟組織CARD9表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化激活均顯著增加，而敲除CARD9不僅會(huì)下調(diào)小鼠心臟組織中p38 MAPK的活性，并且可減少小鼠心臟中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)量及心肌、血漿和巨噬細(xì)胞衍生的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β及腫瘤壞死因子α（TNF-α），在一定程度上改善心臟肥大、纖維化和心肌功能障礙［12-13］。在缺血45 min后再灌注24 h的小鼠MIRI模型中發(fā)現(xiàn)，CARD9-/-小鼠比野生型（WT）對(duì)照小鼠梗死面積更小，心臟和血清中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、磷酸化p38 MAPK及細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、CXC趨化因子配體1（CXCL1）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）水平下降，提示敲除CARD9對(duì)心肌再灌注損傷起一定的保護(hù)作用［14］。此外，秦星［15］研究也發(fā)現(xiàn)，CARD9在MIRI的心肌組織中含量升高，且這種升高與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，敲除CARD9可通過(guò)阻斷NOD2-MAPK通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減弱MIRI后心臟功能的損害程度，并且在MIRI環(huán)境中，CARD9可能還參與了其他模式識(shí)別受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在另一項(xiàng)研究中，研究者使用小干擾RNA（siRNA）對(duì)急性胰腺炎大鼠進(jìn)行了CARD9基因沉默，發(fā)現(xiàn)沉默CARD9的大鼠胰腺組織中NF-κB p65和p38 MAPK表達(dá)下降，并且中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和髓過(guò)氧化物酶活性顯著減弱，提示沉默CARD9基因可以減少胰腺組織中的炎癥反應(yīng)［16］。由上可見(jiàn)，基于CARD9及p38 MAPK在炎癥反應(yīng)中的作用，抑制p38 MAPK依賴(lài)性過(guò)度活躍的炎癥反應(yīng)可能是MIRI的潛在治療策略，靶向產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子及吸引浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞進(jìn)入心肌的趨化因子有可能成為未來(lái)對(duì)抗MIRI的新方向。

1.2 通過(guò)激活NLRP3炎癥小體調(diào)控心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng) NLRP3炎癥小體是一種與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞死亡形式，NLRP3可以募集含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）的前體和含有CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白以形成NLRP3炎癥小體，其介導(dǎo)的Caspase-1信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，在MIRI中可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生和心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)而引發(fā)心室重構(gòu)［17］。目前，只有少數(shù)研究探索了CARD9信號(hào)介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活在MIRI中的作用機(jī)制，但通過(guò)其他研究結(jié)果或許可以間接了解兩者的關(guān)系。CARD9在真菌感染中可上調(diào)IL-1β的產(chǎn)生，而在小鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞中卻抑制脾酪氨酸激酶（Syk）磷酸化并抑制之后的NLRP3活化及Caspase-8向炎癥小體的募集，負(fù)向調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，以響應(yīng)沙門(mén)菌感染［18］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（Ripk2）是一種在NLRP3炎癥小體激活期間通過(guò)與Caspase-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)抑制NLRP3活性的分子，XU等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥小鼠模型中，CARD9-/-小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腸道炎癥和腸道屏障功能障礙，CARD9可通過(guò)募集Ripk2來(lái)抑制NLRP3炎癥小體的過(guò)度激活和隨后IL-1β、IL-18的過(guò)度產(chǎn)生。因此，CARD9可視為NLRP3炎癥小體激活的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在MIRI及其他心血管疾病中的作用有待進(jìn)一步研究。

2 CARD9通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

心肌細(xì)胞凋亡可誘導(dǎo)心臟重構(gòu)并導(dǎo)致多種心血管疾病以致心功能障礙［20］，多項(xiàng)研究表明，CARD9在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。線粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡是MIRI后心肌細(xì)胞死亡的一種突出形式，其特征是誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡小體［21］。凋亡小體是一種多亞基蛋白復(fù)合物，可作為半胱天冬酶激活的平臺(tái)。LI等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CARD9在 H9c2心肌細(xì)胞中受過(guò)氧化氫的刺激而表達(dá)增加，而CARD9的缺失能夠顯著增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)；進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CARD9的CARD結(jié)構(gòu)域有助于抑制線粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。同時(shí)，與WT小鼠比較，CARD9-/-小鼠在MIRI后表現(xiàn)出更高數(shù)量的凋亡細(xì)胞，CARD9可通過(guò)與Apaf-1結(jié)合使細(xì)胞色素C-Apaf-1-proCaspase-9凋亡復(fù)合體分離，從而減少心肌細(xì)胞凋亡。PETERSON等［23］研究也表明，CARD9在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，主要通過(guò)抑制Caspase-9的激活來(lái)減少心肌細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)提示心肌細(xì)胞上的CARD9在應(yīng)激環(huán)境下表現(xiàn)出抗凋亡作用以保護(hù)心臟，這與其在炎癥反應(yīng)中的作用不同。YAN等［24］在心肌梗死后第3天觀察到Dectin-2（一種在骨髓細(xì)胞上表達(dá)的模式識(shí)別受體）敲除小鼠的梗死愈合改善和心肌細(xì)胞凋亡率下降，而這一結(jié)果歸因于激活了Syk-CARD9-NF-κB通路誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。CARD9對(duì)心肌細(xì)胞影響的差異除了CARD9信號(hào)傳導(dǎo)的不同通路之外，還可能因?yàn)樗芯考?xì)胞類(lèi)型的不同而產(chǎn)生，比如CARD9在心肌細(xì)胞上表現(xiàn)出抗凋亡作用［22］，而在骨髓細(xì)胞上可能表現(xiàn)出促凋亡作用［24］。也就是說(shuō)，不同的細(xì)胞環(huán)境可能存在不同的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制。鑒于CARD9介導(dǎo)的心血管疾病中有關(guān)心肌細(xì)胞凋亡的研究數(shù)量有限，在未來(lái)希望可以從關(guān)于CARD9上游靶標(biāo)的研究中找到一些線索，以更好地解釋這種差異。

3 CARD9通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞自噬介導(dǎo)MIRI發(fā)生發(fā)展

自噬是一種自然的自我清潔過(guò)程，通過(guò)溶酶體降解受損的細(xì)胞器和多余的蛋白質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞在壓力環(huán)境中的平衡［25］，對(duì)于細(xì)胞存活至關(guān)重要。在心血管疾病中，自噬是一把雙刃劍。一方面，自噬是對(duì)限制心臟損傷壓力條件的適應(yīng)性反應(yīng)；另一方面，在某些壓力條件下，過(guò)度的自噬激活可能對(duì)心臟有害［26］。及時(shí)再灌注是治療AMI的有效方法，能夠最大限度減少血流恢復(fù)時(shí)間，對(duì)于治療AMI和減少再灌注損傷至關(guān)重要。研究顯示，MIRI后活性氧激活可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生自噬［27］。LI等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧或過(guò)氧化氫反應(yīng)中，CARD9表達(dá)在MIRI小鼠心臟、H9c2心肌細(xì)胞及新生大鼠心室肌細(xì)胞中增加；且與WT小鼠相比，CARD9-/-小鼠在MIRI后表現(xiàn)出更明顯的心功能障礙。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究顯示，在體外和體內(nèi)MIRI過(guò)程中，CARD9的缺失均可通過(guò)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）酯化和p62（一種已知會(huì)被自噬降解的蛋白質(zhì)）積累減少抑制自噬。自噬的發(fā)生有3個(gè)關(guān)鍵步驟，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合成熟、自噬溶酶體形成。自噬體可以通過(guò)組成復(fù)合物來(lái)刺激形成，該復(fù)合物包含紫外線輻射抗性相關(guān)基因（UVRAG）、自噬相關(guān)基因beclin-1及磷脂酰肌醇3激酶催化亞基3（PI3KC3）。Rubicon是一種公認(rèn)的自噬負(fù)調(diào)節(jié)因子，LI等［28］研究顯示，CARD9可以與UVRAG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Rubicon，導(dǎo)致UVRAG釋放與beclin-1、PI3KC3組成復(fù)合物，最終促進(jìn)自噬體的形成、成熟和內(nèi)吞作用，提示心肌細(xì)胞中CARD9與Rubicon能夠相互作用，以恢復(fù)自噬通量來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞免受MIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和損傷。然而，PETERSON等［29］在主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的壓力過(guò)載致心功能障礙小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CARD9-/-減輕了小鼠心功能障礙，并且可以觀察到自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3BⅡ（LC3BⅡ）/LC3BⅠ的比值增加，自噬受體蛋白p62表達(dá)降低，提示CARD9-/-恢復(fù)了功能失調(diào)的心肌自噬。這一結(jié)果與LI等［28］研究結(jié)論相反，這種不一致可能是由于使用了不同的模型，導(dǎo)致疾病環(huán)境有所差異造成的。PETERSON等［29］研究的是慢性疾病模型，而LI等［28］研究的是急性損傷模型。這也提示我們，CARD9通過(guò)上調(diào)自噬來(lái)保護(hù)心肌的作用可能只在急性心肌損傷中發(fā)揮作用，因此，未來(lái)需要更多研究來(lái)驗(yàn)證和確認(rèn)這些結(jié)論。

綜上所述，CARD9信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)的促炎作用已被證實(shí)參與MIRI的心臟損傷及重塑，因此，通過(guò)靶向干預(yù)CARD和CARD9介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行抗炎治療可能是一個(gè)很有前景的選擇。目前，體內(nèi)干細(xì)胞注射治療心肌梗死的方案已在研究中，ZHAO等［30］在注射干細(xì)胞的心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)CARD9-/-小鼠的早期死亡率降低，并且含有T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的肉芽腫形成較對(duì)照組小鼠明顯減少，提示CARD9的免疫抑制作用可預(yù)防體內(nèi)干細(xì)胞治療中巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的急性免疫損傷，進(jìn)而保護(hù)MIRI后的心功能并可顯著提高患者存活率。此外，有學(xué)者認(rèn)為CARD9是鋅離子介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在靶標(biāo)，WANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，鋅補(bǔ)充劑可以通過(guò)抑制CARD9/BCL10信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)預(yù)防小鼠模型中與肥胖相關(guān)的心臟肥大，鋅可以與CARD9的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制CARD9-CARD聚合成螺旋體，從而抑制CARD9/BCL10信號(hào)傳導(dǎo)。最新研究顯示，CARD9的化學(xué)抑制劑BRD5529可以顯著降低肺孢子菌肺炎小鼠肺組織中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生以減輕肺部炎癥，研究者同時(shí)對(duì)BRD5529用于臨床研究的安全性進(jìn)行了驗(yàn)證，研究結(jié)果數(shù)據(jù)支持對(duì)該抑制劑進(jìn)行更為廣泛的體內(nèi)測(cè)試，以期作為治療宿主免疫反應(yīng)的輔助治療［31］。但是，迄今為止，關(guān)于CARD9與MIRI的相關(guān)研究仍然有限，尤其對(duì)CARD9在不同細(xì)胞類(lèi)型（如骨髓細(xì)胞和心肌細(xì)胞）中的確切機(jī)制需要進(jìn)一步探索。因此，針對(duì)CARD9的未來(lái)研究應(yīng)關(guān)注其在MIRI中的主要上、下游分子以及與其他信號(hào)分子的串?dāng)_，同時(shí)對(duì)于CARD9的表觀遺傳修飾機(jī)制，如磷酸化和泛素化等進(jìn)行更深入的研究。期待有更多關(guān)于CARD9的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究出現(xiàn)，或可會(huì)為MIRI的治療開(kāi)辟新的方向。