尿路致病性大腸桿菌與宿主相互作用的研究進展①

周靖軒 袁春玲 向晨焱 王 君 鄒黎黎

（三峽大學基礎醫學院，腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443000）

泌尿系感染（urinary tract infections，UTI）每年困擾著全球約1.5億人，約有50%的女性在其生命周期中被UTI所困擾，其中25%的女性在首次感染后6個月內出現復發性尿路感染（recurrent UTI， rUTI），甚至部分患者在初次發生感染后1年內出現6次以上的反復感染，嚴重影響患者的生理和心理健康。導致UTI最常見的病原體是尿路致病性大腸桿菌（uropathogenicE.coli，UPEC），約80%的社區獲得性UTI和50%的院內UTI均由UPEC引起［1-5］。在感染發生發展過程中，宿主表現出復雜的主要由尿路上皮細胞和中性粒細胞介導的免疫防御能力，如尿路上皮細胞的屏障作用、中性粒細胞的遷移和吞噬作用。除此之外，還有細胞因子的殺傷作用等［6-7］；同時，UPEC的自身結構合并其分泌的毒力因子可打破宿主屏障，并對抗中性粒細胞的免疫應答以逃避宿主的免疫清除。鑒于感染期間復雜的病原體-宿主反應與病原體的侵入和反復感染密切相關，因此深入理解UTI中宿主-病原體的免疫相互作用勢在必行，以期為臨床治療提供一定的參考。

1 膀胱上皮

膀胱上皮細胞（bladder epithelial cells，BEC）是宿主抵抗病原體入侵的第一道防線，其不僅是一個高度致密的物理屏障，其上分布的各種細菌受體也可高效抵御UPEC感染。膀胱上皮（即移行上皮）由基底細胞層、中間細胞層和淺表頂層組成。淺表頂層也被稱為傘狀細胞，其表面有由尿空斑蛋白（uroplakins，UPs）組成的剛性斑塊，在維持屏障方面發揮著重要作用［8］。即便如此，UPEC仍可依靠各種生物作用打破BEC的防御作用［9］：①黏附作用。KAPER等［10］，DUNCAN等［11］和CHAHALES等［12］研究發現，UPEC可通過與UPs結合而黏附至宿主細胞，雖然排尿期間尿液的沖刷作用可排出大部分的細菌，但殘留的細菌會在營養豐富的尿液中完成增殖并定殖于尿道上皮。②入胞作用。傘狀細胞中具有膜運輸作用的細胞器：梭形囊泡（fusiform vesicles，FV），其功能受特定細胞膜內面的Rab GTP酶調節。BEC含有大量由RAB27b調節的FV，正常生理情況下FV作為額外膜儲存在細胞內。當尿液積聚導致膀胱擴張時，FV以cAMP依賴性方式發生胞吐作用以提供膀胱擴張所需的額外膜；排尿后額外膜再次以FV的形式回到細胞內［13-15］。為了侵入上皮細胞，UPEC在細菌黏附的部位觸發局部cAMP爆發導致FV融合至細胞膜。當這些膜回到細胞內時，黏附在細胞膜上的細菌被包裹在FV中從而進入上皮細胞內［9，14］。藏匿在FV中的UPEC不僅無法被溶酶體吞噬，而且可以迅速復制形成細胞內菌落（intracellular bacterial community，IBC）。這種結構具有生物膜樣特性，可抵抗宿主先天防御和抗生素的殺傷［16-17］。③抑制溶酶體的吞噬作用。如上所述，膀胱上皮細胞表面具有迅速識別細菌入侵的受體，如Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR5和TLR11）［18］。SONG等［19］研究發現，TLR4被激活后可上調細胞內cAMP的水平導致FV發生胞吐使得囊泡內細菌被清除至膀胱腔。為了躲避Toll受體介導的清除作用，UPEC從FV中逃逸至細胞質，此時細胞的自噬系統被激活，細菌被包裹在自噬體中并通過多泡體轉運至溶酶體。然而，UPEC可調節PH值使溶酶體失活并在溶酶體內存活，這些失活溶酶體被位于溶酶體膜上的瞬時受體電位黏蛋白3（transient receptor potential mucolipin 3，TRPML3）監測到，隨后迅速被排出到胞外［20］。感染后不久，宿主由TLR4介導的FV胞吐以及自噬相關的溶酶體排出發揮作用，這些高效的外排機制可在24 h內排出BEC內80%以上的細菌［14］。④上皮脫落。當所有外排機制均無法有效清除UPEC時，BEC激活最后一道防線即上皮脫落，從而清除被細菌黏附和感染的上皮細胞。BEC剝脫對于UPEC的清除至關重要，尤其是作為針對細胞內UPEC的一線防御［21］。嚴重感染者的尿液中含有大量脫落的BEC，表明上皮脫落是 一種常用的宿主防御機制［22-23］。上皮脫落由胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8相關的凋亡引起，為了對抗這種劇烈刺激，基底上皮迅速轉變為快速增殖狀態，在數小時內迅速替換脫落細胞并恢復尿路上皮屏障［24-25］。新近研究發現BEC死亡與NLRP3炎癥體途徑的激活和胱天蛋白酶-1激活有關［21］。然而，感染的BEC引發的上皮脫落是一把雙刃劍，雖然它可以消除大量細菌，但也會使稚嫩細胞暴露于尿液中的細菌［23］。實際上，表面上皮細胞的死亡是由某些毒性UPEC有意誘導，以更好地到達BEC深層以形成靜止的細胞內儲庫（quiescent intracellular reservoirs，QIR），從而在上皮細胞中持續存在。因此，上皮細胞中QIR的存在與膀胱感染的高復發和抗生素耐藥密切相關［26］。

綜上可知，BEC強大的屏障功能，高效的細菌外排機制以及徹底的上皮脫落能夠有效抵御細菌的黏附與侵入。然而，病原體依舊可利用細胞膜上的UPs黏附至細胞表面，利用膀胱膜運輸特性進入細胞內形成IBC，在上皮脫落時入侵上皮細胞形成QIR，導致UTI的反復復發與治療難度增加。

2 中性粒細胞

中性粒細胞是膀胱炎發生后機體清除細菌的主要吞噬細胞，細菌入侵時激活BEC表面的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）從而分泌IL-8，誘導中性粒細胞離開血管遷移至固有層，穿透基底膜和淺表上皮進入膀胱腔清除細菌［27-28］。但是那些被巨噬細胞分泌的CXC趨化因子配體1（CXCL1）和巨噬細胞遷移抑制因子募集來的中性粒細胞需要局部的腫瘤壞死因子信號傳導才能穿過上皮的基底膜［27］。此外中性粒細胞的跨上皮運動也需要TNF，誘導巨噬細胞LY6C分泌第二波細胞因子，主要是CXCL2。它可以刺激中性粒細胞產生基質金屬蛋白酶9，和IL-10一起啟動中性粒細胞跨上皮運動［29］。中性粒細胞數量與細菌負荷成正比，在感染后2 h內到達膀胱上皮并在6 h達峰［30］。HARAOKA等［31］研究發現，中性粒細胞反應缺陷的小鼠對UTI的易感性顯著增加且清除細菌感染的能力降低，表明中性粒細胞在細菌清除中扮演重要角色。中性粒細胞可將高水平的鋅調集至被吞噬的微生物，利用鋅的毒性可能是保守的先天免疫抗微生物反應［32］。但中性粒細胞釋放的活性氧和細胞毒性產物可介導組織損傷。HANNAN等［33］研究發現，非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）或環氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑對小鼠UTI具有顯著的治療效果。COX-2抑制劑在不影響BEC剝落和其他宿主固有清除的情況下限制中性粒細胞遷移至泌尿道，減少膿尿和黏膜損傷并降低慢性膀胱炎的發生率。雖然中性粒細胞可確保機體在排泄過程中及時清除細菌，但是中性粒細胞的募集在UTI期間可引起嚴重病理反應，表明尿液中大量的中性粒細胞是宿主防御的副產物［31］。然而過度的免疫應答也與炎癥疾病有關。新近研究表明Forskolin可明顯減少小鼠炎癥組織中CD45+Ly6G+細胞（中性粒細胞高度特異性）的數量，適當減少中性粒細胞的產生減輕病理反應［34］。此外，Forskolin治療的小鼠也可降低中性粒細胞IL-1β和TNF-α mRNA的表達。中性粒細胞的耗竭不僅可以減緩組織破壞，同時也可以減少細菌負荷［34］。

UPEC具有針對中性粒細胞募集和吞噬功能的毒力機制，通過下調中性粒細胞趨化、促炎、黏附和遷移相關的基因表達抑制中性粒細胞遷移。①上調吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）表達。UPEC在體外以及細菌性膀胱炎的小鼠模型中均可誘導哺乳動物IDO1基因的局部表達［35］。研究表明，UPEC可減少體內外中性粒細胞經膀胱上皮的遷移，誘導中性粒細胞和尿路上皮細胞內的抗炎分子產生，如IDO［36-38］。IDO可介導犬尿氨酸的產生，在體外對黏附性中性粒細胞的形態學分析表明犬尿氨酸直接影響中性粒細胞的運動［35］。IDO參與色氨酸分解代謝，通過色氨酸局部匱乏以及犬尿氨酸的局部代謝分解產物來調節適應性免疫；UPEC在侵入小鼠膀胱后1 h內局部特異性上調IDO，導致中性粒細胞募集減弱；IDO缺陷小鼠中性粒細胞在UTI中遷移增強，使細胞外細菌的殺傷增加和感染減弱［35，39］。且進一步研究表明，UPEC會在膀胱炎期間誘導局部TNF-α分泌，從而破壞先天性免疫介導的鋅毒性，TNF-α和IFN-γ的持續作用是UPEC誘導宿主中IDO上調的基礎［39-41］。②釋放YbcL。LAU等［38，42］的研究證實，隨細菌裂解而釋放存在于細菌周質中的效應物YbcL，可在體內和體外模型中抑制中性粒細胞跨上皮遷移。YbcL抑制中性粒細胞遷移需要尿路上皮細胞，并通過細菌暴露于BEC而增加細菌裂解從而達到釋放YbcL的目的［42］。③分泌α溶血素。為了抵抗中性粒細胞的吞噬， UPEC分泌α溶血素發揮免疫調節和抑制粒細胞的趨化及吞噬活性作用［43-46］。④分化成絲。在IBC成熟期間，少數細胞菌落通過分化途徑形成長度70 μm的非分離的絲狀細菌［16，47］。當含有IBC的上皮細胞裂解時，UPEC從IBC中流出進入膀胱腔，而絲狀UPEC（1～2 μm）則可以抵抗吞噬作用［16，48］。事實上，中性粒細胞能夠吞噬比自身更大的顆粒（例如真菌菌絲），絲狀UPEC的抗吞噬作用可能依賴于其大小超出吞噬的極限［16，49-50］。綜上可知，中性粒細胞在UTI過程中募集和吞噬清除病原體，而UPEC為了抵抗中性粒細胞的免疫清除作用，上調IDO的表達、釋放YbcL、分泌α溶血素抑制中性粒細胞的遷移與募集，還可分化成絲以逃避中性粒細胞的吞噬。

3 抗菌因子

泌尿道炎癥反應主要通過激活Toll樣受體（TLR）而引發。UPEC感染后不久，PRR即被激活，細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激TLR4激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）途徑或誘導尿路上皮cAMP的增加進而導致IL-6和IL-8表達增加［51-53］。此外，NOD-樣受體/胱天蛋白酶-1途徑的激活也會導致IL-6和IL-1β的大量爆發［21，51］。這些細胞因子與BEC分泌的其他炎癥介質一起導致免疫細胞迅速流入上皮細胞以抵抗細菌攻擊，如抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），抗菌蛋白。Cathelicidin LL-37是由BEC分泌的小分子量的陽離子AMP，可直接殺死細菌。CHROMEK等［54］研究發現，感染5 min后BEC內的cathelicidin mRNA表達升高，敲除LL-37直系同源物的小鼠感染后1 h內膀胱UPEC負荷急劇增加，揭示了AMP快速和強大的抗菌作用。UTI期間防御素類AMP β-防御素也局限性增加［55］。這兩種AMP都有助于細胞因子的產生、中性粒細胞的募集、溶解或抑制黏附細菌［56］。最近研究發現，可溶性模式識別分子五聚蛋白相關蛋白3（pentraxin-related protein，PTX3）可刺激補體介導吞噬從而預防UTI。感染后泌尿道中PTX3水平增加，PTX3敲除小鼠的抗感染能力降低。此外，核糖核酸酶7是另一種抗菌劑，對許多常見尿路病原體具有迅速和廣譜的殺菌活性［57］。

為了應對機體細胞因子與炎癥介質的作用，UPEC可通過：LPS修飾和效應子顯著抑制抗菌因子的產生。UPEC可以穩定NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）從而抑制NF-κB活性并增加BEC凋亡［58］。研究發現，多個UPEC分離株可在尿路上皮細胞誘導低水平的IL-6和IL-8，并與已知的NF-κB刺激物共接種后能夠阻止這些炎癥細胞因子的分泌［59-60］。LPS的生物合成在其中發揮重要作用，UPEC LPS修飾可能產生一個低刺激性的LPS結構，抑或者是非刺激性LPS發揮主導作用［59，61］。然而，僅僅是LPS差異并不能解釋細胞因子的抑制，其他機制和UPEC效應也可能有助于抑制細胞因子的分泌，例如亞裂解濃度的α溶血素可抑制NF-κB信號傳導以及IL-6的分泌［62-65］。大部分UPEC編碼含有Toll/IL-1受體（TIR）結構域的蛋白質，稱為TcpC，與宿主銜接子MyD88相互作用以抑制TLR信號傳導［66］。關于TIR結構域蛋白其他信號通路的進一步研究表明，TcpC可獨立于MyD88調節TLR通路， 因此TcpC可能以更廣泛的方式影響發病機制［67］。NLRP3炎癥小體和IL-1β對于UTI的建立和發展都是非常重要的，UPEC是可調節NLRP3炎癥小體激活和IL-1β釋放的毒力因子，從而影響UPEC BEC的黏附與定植［21，68-70］。總之，在UTI期間尿路上皮分泌細胞因子、AMP和抗菌蛋白抑制或殺傷病原體，然而UPEC可通過LPS修飾和效應子抑制炎癥因子的產生從而逃避宿主的清除，且一些促炎細胞因子具有改變UPEC毒性特征的能力［71］。即便如此，目前AMP作為疫苗抗原用于抗擊UTI的新策略的疫苗開發上。此外，鐵載體，黏附素等也可以成功防御UTI［72-75］。了解這些細胞因子是如何影響UPEC以及宿主的免疫防御，對制定針對這些細胞因子為靶標替代傳統抗生素的治療策略至關重要。

4 展望

UTI中宿主與病原體的免疫相互作用極其復雜，詳細深刻的理解其機制有助于開發新的治療方法，比如針對病原體的黏附和生物膜形成過程、破壞細菌對中心粒細胞、細胞因子的抑制；針對宿主刺激感染的組織細胞對病原體侵襲反應增強從而引發和增強免疫反應。針對UPEC感染治療的直接策略是針對細菌的生存力，膀胱上皮的黏附和生物膜的形成。而間接策略是通過刺激受感染的組織和細胞對UPEC入侵過度反應引發和增強免疫反應［76］。然而宿主的炎癥反應是一把雙刃劍，急性膀胱炎期間過度旺盛的炎癥可增加組織的損傷，更容易發展為慢性復發性感染，導致病原體持久駐留在上皮內而無法被免疫系統清除。因此，宿主需要進行精細的免疫調節以消除尿路病原體，同時避免可能增加疾病嚴重性或促進持續感染的炎癥反應。一旦形成慢性復發性感染，需要開發新的治療方法以徹底清除細胞內駐留的細菌。關于泌尿系感染中宿主-病原體免疫相互作用的詳細機制和相對應的治療措施，亟待下一步研究。