miRNA在原發(fā)性腎小球疾病診斷及治療中應用的研究進展①

于 瑤 劉建華 吳麗娜 （中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004）

原發(fā)性腎小球疾病已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)病理類型不同，臨床常見的原發(fā)性腎小球疾病有IgA腎病、特發(fā)性膜性腎病、微小病變性腎病等，病情發(fā)展到后期都會發(fā)生腎臟纖維化，若未能及時干預，最終將發(fā)展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD），只能采取透析或腎臟移植治療，給患者本人、家庭及社會帶來巨大負擔。

微小RNA（microRNA，miRNA）是目前研究最廣泛的一種非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），miRNA與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）、環(huán)狀RNA等ncRNA共同作用調控各水平基因表達，參與器官發(fā)育、疾病發(fā)生等機體的生理和病理過程。本文將對miRNA在原發(fā)性腎小球疾病中的作用進行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類由內源基因編碼的，長約19～ 25個核苷酸的單鏈RNA分子。原始miRNA在核中經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ與Drosha加工為pre-miRNA，經(jīng)Exportin-5轉運，在細胞質中被RNaseⅢ家族成員Dicer裂解，變成長約22 nt的雙鏈體miRNA，與 Argonaute（Ago）蛋白結合到RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，由于雙鏈體兩條鏈頂端熱力學穩(wěn)定性不同，最終僅一條鏈作為成熟miRNA保留下來［1-2］。miRNA通過抑制翻譯并加速靶標mRNAs的降解以沉默基因表達，起到轉錄后調節(jié)作用［3］。一個miRNA可以有多個靶基因，也存在多個miRNAs擁有相同的靶基因，交織成 一個復雜的基因調控網(wǎng)絡。NAKAGAWA等［4］和RUDNICKI等［5］利用微陣列技術對腎臟組織標本進行了miRNA和mRNA表達譜分析，共鑒定出55種差異表達的miRNAs，其中miR-30d、miR-532-3p、miR-140-3p、miR-190、miR-206與腎臟功能進行性降低有關，表達下調的miRNAs對應的靶mRNA參與炎癥反應、細胞凋亡及信號轉導。細胞外miRNA通過囊泡、外泌體或與Ago2載體結合等形式存在并發(fā)揮作用，具有較高的穩(wěn)定性，具備作為生物標志物的潛力［6-8］。

2 miRNA與原發(fā)性腎小球疾病

2.1 生物標志物作用 近年來研究人員應用高通量手段揭示了健康人和原發(fā)性腎小球疾病患者間、不同類型原發(fā)性腎小球疾病患者間miRNA表達譜的差異，再從中挑選出具有代表性的miRNA作為生物標志物以輔助臨床診斷、反映疾病分期、評估病情活動或緩解、預測治療反應等［9-10］。如miR-204、miR-152-5p、let-7b和miR-148b在IgA腎病中特異表達，可作為IgA腎病的診斷標志物，miR-30a-5p水平可反映IgA腎病的治療效果［11-14］。miR-30a-5p、miR-490、miR-17、miR-451和miR-106a能夠作為局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）的診斷標志物，同時也能反映疾病是否處于活動期［14］。尿液中miR-10a、miR-30d、miR-3613-3p和miR-4668-5p含量可提示腎臟損傷的嚴重程度［15-16］。相較于腎臟組織標本，體液標本在臨床上獲取方便，因此體液miRNA作為生物標志物輔助診斷、監(jiān)測病情和預后有更大的應用空間。

2.2 參與腎臟纖維化 幾乎所有的原發(fā)性腎小球疾病進展到后期都會發(fā)生腎臟纖維化，發(fā)生固有細胞損傷和丟失、炎癥細胞浸潤、成纖維細胞活化增殖、細胞外基質堆積、腎小管萎縮塌陷等改變。miRNA作用于各種信號通路促進或抑制纖維化進展，如TGF-β相關的TGF-β/Smads經(jīng)典信號通路［17］。LIAO等［18］研究表明，miR-140-5p直接靶向轉化生長因子β受體1（TGFBR1）抑制TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮腎臟保護作用。miR-21作用于PTEN/Akt通路，miR-206作用于JAK/STAT通路，miR-199a-3p作用于p53/SOCS7/STAT3通路等均在一定程度上改變了腎臟纖維化進程［19-21］。除此之外miR-382下調熱休克蛋白60，降低腎組織抗氧化能力，促進腎小管間質纖維化［22］。miR-4709-3p和靶標CALM3影響細胞內鈣離子水平參與纖維化［23］。miR-21-5p、miR-199a-5p、miR-150-5p和miR-214-3p的表達與IgA腎病腎臟纖維化相關，外泌體miR-200b含量隨纖維化進展而降低，可用miRNA水平表示腎臟纖維化程度［24-26］。促進或抑制相關miRNAs表達也為未來延緩甚至逆轉纖維化進程提供可能。

2.3 在治療中的應用 目前原發(fā)性腎小球疾病的治療主要為應用血管緊張素轉換酶抑制劑等的保守治療和免疫抑制治療。免疫抑制劑又分為類固醇激素類、烷化劑類如環(huán)磷酰胺、鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑類如他克莫司和環(huán)孢素A，以及B淋巴細胞表面抗原CD20的單克隆抗體——利妥昔單抗等。鈣調神經(jīng)磷酸酶是T細胞活化的關鍵酶，鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑能夠阻斷鈣調神經(jīng)磷酸酶的信號傳導途徑及促炎細胞因子產(chǎn)生，起到保護足細胞的作用。研究表明TGF-β通過Smad信號通路下調miR-30，miR-30s靶向鈣調神經(jīng)磷酸酶蛋白PPP3R1阻止鈣調神經(jīng)磷酸酶的活化，維持足細胞骨架完整。利用miR-582-5p與PPP3R1基因單核苷酸多態(tài)性不同等位基因的親和力差異改變PPP3R1表達，可增強他克莫司和環(huán)孢素A對足細胞的保護作用［27-28］。研究者也在尋找新型治療方法，比如在體外實驗中使用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子下調miR-134表達，增強miR-132信號傳導能促進LIM域激酶1（Limk1）的翻譯和磷酸化，促進足細胞骨架合成，修復損傷的足細胞［29］。雖然將miRNA用于治療的研究還處于初級階段，但可為臨床治療原發(fā)性腎小球疾病提供新思路。

3 miRNA在不同腎小球疾病中的作用

3.1 miRNA與膜性腎病 膜性腎病好發(fā)于成年人，是一種自身免疫性腎病，表現(xiàn)為腎小球上皮下免疫復合物沉積，磷脂酶A2受體（phospholipase A2 receptor，PLA2R）、1型 血 小 板 反 應 蛋 白7A域（THSD7A）等足細胞抗原對膜性腎病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用［30-31］。miRNA通過多種途徑參與IMN，例如：①細胞損傷。miR-193a抑制下游WT1和PODXL兩種蛋白表達破壞足細胞穩(wěn)定性，造成足細胞損傷［32］。IMN患者尿液中miR-193a表達上調，WT1和PODXL表達下調，聯(lián)合檢測尿液標本三者的含量可用來評估IMN的發(fā)病和預后［33］。miR-378a-3p靶向腎小球基底膜基質成分腎連蛋白（nephronectin，NPNT），通過與整合素α8β1結合導致足細胞形態(tài)改變，細胞骨架重排，細胞凋亡［34］。miR-193-3p靶向RAS癌基因家族成員RAB1A與細胞自噬相關［35］。血漿miR-217顯著下調，靶向腫瘤壞死因子超家族成員11（TNFSF11）導致細胞凋亡［36］。細胞損傷導致濾過屏障被破壞，腎小球硬化。②細胞周期停滯。miR-195-5p靶向磷酸酶PP2C家族成員PPMIA，PPMIA對M1型單核細胞向巨噬細胞分化和TGF-β1/SMAD3通路介導的腎纖維化均有負調控作用［37-38］。miR-328-5p調節(jié)BRSK1表達可能 通 過PI3K/Akt通路影響細胞周期，let-7a-5p、let-7c-5p、miR-107、miR423-5p靶向細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）和原癌基因MYC導致細胞周期停滯，細胞周期G2/M停滯會使腎病發(fā)生慢性化和纖維化［39-41］。③炎癥反應。let-7a-5p、let-7c-5p、miR-107靶向IL-6調控炎癥反應影響IMN發(fā)病。miR-217受X染色體失活特異轉錄物（lncRNA XIST）負向調控，使miR-217的靶標Toll樣受體4（TLR4）表達增加，促進足細胞凋亡，通過抑制XIST減輕對miR-217的抑制作用可延緩膜性腎病進展［42］。

3.2 miRNA與IgA腎病 IgA腎病是最常見的腎小球疾病，腎小球系膜區(qū)存在以IgA為主的沉積物，也被認為是一種自身免疫性疾病。已知的發(fā)病機制中較為核心的是與IgA1異常糖基化相關的免疫損傷機制，半乳糖缺陷IgA1（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）作為自身抗原被抗體識別，引起一系列免疫反應，包括關鍵酶β-1，3-半乳糖基轉移酶（β-1， 3-galactosyltransferase 1，C1GALT1）、半乳糖基轉移酶伴侶蛋白（Cosmc）、T淋巴細胞、B淋巴細胞等成分［43-45］。miRNA參與調控IgA1異常糖基化，如在IgA腎病患者外周血單核細胞（PBMC）中miR-98-5p上調，可能靶向趨化因子3（CCL3），提高IL-6水平，降低C1GALT1表達，miR-148b過表達直接靶向C1GALT1下調［46］。miR-133a和miR-133b靶向影響調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）發(fā)育和功能的重要調控因子FOXP3，抑制Treg分化。miR-21上調誘導輔助性T細胞17（Th17）極化，miR-155下調導致Th2、Th17增加，Th1、Treg減少，T細胞亞群的這種變化會抑制Cosmc表達，影響IgA1糖基化［47］。類似可上調Gd-IgA1的miRNAs還有miR-320、miR-374b等［48-49］。miRNA還通過調節(jié)炎癥反應參與IgA腎病的發(fā)生發(fā)展，如miR-29b-3p調控周期蛋白依賴性激酶6表達，影響核轉錄因子-κB（NF-κB）活化，增強炎癥反應，促進IgA腎病發(fā)生［50］。miR-200bc/429簇調控腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導劑及其受體成纖維細胞生長誘導因子14系統(tǒng)，miR-233靶向炎癥小體NLRP3均可抑制下游炎癥因子釋放，減輕IgA腎病患者的炎癥反應，具有特異性治療IgA腎病的潛力［51-52］。

3.3 miRNA與局灶節(jié)段性腎小球硬化 FSGS主要由足細胞損傷引起，是最容易發(fā)展為ESRD的腎小球病變類型。miR-206和miR-193a抑制Wilms'腫瘤基因（WT1），影響足細胞穩(wěn)態(tài)調節(jié)劑足萼糖蛋白、NPHS1基因等表達，引發(fā)級聯(lián)反應造成足細胞損傷［32，53］。miR-135a/b通 過 抑 制 糖 原 合 酶 激 酶3β（GSK3β）表達來激活Wnt/β-catenin信號傳導，破壞足細胞骨架，誘導足細胞功能障礙［54］。在小鼠試驗中蛋白激酶P38和轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白β（C/EBPβ）刺激上調lnc-RNA LOC105374325，使miR-34c和miR-196a/b下調，上調BCL-2相關X蛋白（Bax）和Bcl-2同源拮抗/殺傷蛋白（Bak）水平，引起足細胞變性損傷，導致FSGS發(fā)生。激活補體片段C3a/p38/XBP-1s途徑可誘導腎小管細胞中l(wèi)ncRNA LOC105375913表達，降低miR-27b含量，增加FSGS患者腎小管細胞中鋅指轉錄因子水平，誘導腎小管間質纖維化［55］。更多的是生物標志物相關研究，例如miR-186水平與FSGS患者蛋白尿程度相關，miR-125b和miR-186能反映類固醇激素對FSGS的治療效果，尿液miR-196a含量可提示FSGS預后等［56-57］。

3.4 miRNA與微小病變腎病 微小病變腎病（minimal change disease，MCD）是兒童原發(fā)性腎病綜合征最常見的病理類型，光鏡下無特殊改變，電鏡下僅見足細胞足突消失，多為排除診斷，通常應用類固醇激素治療有效［58］。miRNA在MCD中的應用主要是通過表達譜的差異與其他類型腎病鑒別，如與FSGS相比MCD患者血漿miR-30b/c、miR34b/c、miR-342及尿液miR-1225-5p明顯上調，而血清miR-192和miR-205表達下調［10，59］。miR-499可降低小鼠足細胞的鈣調神經(jīng)磷酸酶信號活性，減輕足細胞損傷，改善MCD相關癥狀，具有治療MCD的潛力［60］。

4 結語

目前確診各類腎小球疾病的“金標準”仍然是腎臟穿刺活檢，但在臨床應用中存在創(chuàng)傷較大、耗時較長、取材局限容易漏診（尤其對于FSGS）、復查可能性低等弊端，需尋找操作簡便，同時靈敏度高、特異性強的體液標志物來提高診療效率，miRNA的應用為臨床帶來了更多可能。部分miRNAs可作為輔助診斷腎臟疾病的標志物，且能反映疾病的嚴重程度。但現(xiàn)階段關于miRNA在原發(fā)性腎小球疾病治療領域的研究相對較少，這與腎小球疾病多應用激素、免疫抑制劑等非特異性治療方法有關。此外，由于目前技術水平的局限，miRNA存在特異性不強等缺點，限制了其臨床應用，希望隨著后續(xù)研究的深入和新技術的開發(fā)，miRNA能夠為原發(fā)性腎小球疾病的診療帶來新的突破。