珍珠貝水解肽的制備、氨基酸組成及抗炎活性

沈金鵬 王珂雯 黃潘鈿 陳冰冰 夏 珍 李應(yīng)坤 王湘華 曹 庸 苗建銀 林碧敏

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2. 北海黑珍珠海洋生物科技有限公司，廣西 北海 536000；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐訓(xùn)練中心，廣東 廣州 510642)

炎癥是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)創(chuàng)傷、微生物病原體感染或化學(xué)刺激引起的組織損傷和感染而做出的一種保護(hù)性生理防御機(jī)制[1]。巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最重要的免疫細(xì)胞，也是機(jī)體防御反應(yīng)的重要組成部分，當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激時(shí)，活化的巨噬細(xì)胞能通過(guò)MAPK和NF-κB等通路釋放多種炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，包括促炎介質(zhì)，如一氧化氮(NO)以及促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[2]，這些炎癥因子在誘發(fā)多種炎癥性疾病的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。炎癥免疫反應(yīng)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的過(guò)度積累，可能誘發(fā)機(jī)體功能性障礙以及多種急性、慢性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腸胃炎和過(guò)敏等。因此，抑制活化巨噬細(xì)胞中的促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子有助于炎癥性疾病的治療[3-4]。近年來(lái)，抑制炎癥細(xì)胞因子的合成或活性已成為炎癥治療的主流，促炎細(xì)胞因子抑制劑可作為抗炎藥的候選藥物[5]。最常用的治療藥物是類固醇、非類固醇抗炎藥和單克隆抗體[6]，但其中許多藥物都伴有不良副作用，如降低組織的可修復(fù)性和損傷胃腸黏膜，且炎癥相關(guān)疾病發(fā)病率的增加促使人們尋找具有抗炎特性的天然化合物。在炎癥反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的幾種內(nèi)源性多肽，如血管活性腸肽(VIP)、α-促黑素細(xì)胞激素(αMSH)和腎上腺髓質(zhì)素等已成為抗炎劑，可用于炎癥和自身免疫疾病的新療法[5，7-8]，且?guī)追N合成肽和天然肽，如鱘魚肉水解肽[9]、牡蠣水解肽[10]、雞肉蛋白水解肽[11]等已被證實(shí)可通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生或表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，來(lái)防止過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)又稱合浦珠母貝，是中國(guó)沿海地區(qū)珍珠養(yǎng)殖的主要品種之一[12]。馬氏珠母貝肉營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含多種功效氨基酸和活性肽，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞等藥理作用[13]。然而取珠后的新鮮貝肉僅作為動(dòng)物飼料，原料附加值較低，有待深入研究和高值化開(kāi)發(fā)利用[14]。

研究利用蛋白酶對(duì)馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解，探究酶解制備活性肽的最優(yōu)工藝參數(shù)和條件，并利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7抗炎評(píng)價(jià)模型對(duì)珍珠貝水解肽進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，以期為馬氏珠母貝肉生物活性成分的高值化利用提供理論依據(jù)，為馬氏珠母貝肉抗炎活性肽的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝肉：北海黑珍珠海洋生物科技有限公司；

中性蛋白酶(10 萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶(25萬(wàn) U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn) U/g)和木瓜蛋白酶(20萬(wàn) U/g)：食品級(jí)，南寧龐博生物工程有限公司；

三硝基苯磺酸(TNBS)：分析純，成都化夏化學(xué)試劑有限公司；

噻唑藍(lán)(MTT)：分析純，上海麥克林生物化學(xué)公司；

脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)：生化試劑，美國(guó)Sigma公司；

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)：生化試劑，賽默飛世爾科技公司；

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7：中科院上海細(xì)胞所；

其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市華城海龍實(shí)驗(yàn)儀器廠；

多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：L530型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

電子天平：AL104型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計(jì)：PHS-3CW型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Enspire2300型，美國(guó)PerkinElmer公司；

微量振蕩器：MH-2型，海門其林貝爾儀器制造有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

全自動(dòng)氨基酸分析儀：S-433D型，賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬氏珠母貝肉酶解物的制備 馬氏珠母貝肉洗凈瀝干，打碎成貝肉勻漿，置于-20 ℃冷凍保存。試驗(yàn)時(shí)解凍，稱取一定量貝肉勻漿，按料液比1∶1 (g/mL)加入一級(jí)水，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至最適pH值，按酶底比0.3%加入蛋白酶，在恒溫水浴鍋中酶解3 h，酶解過(guò)程中每30 min攪拌混勻酶解液，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定水解度。將上清液置于-20 ℃凍結(jié)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到珍珠貝水解肽凍干粉，于-20 ℃凍藏備用。

1.3.2 酶解工藝優(yōu)化

(1) 最適酶的篩選：各蛋白酶最適條件見(jiàn)表1，在各種蛋白酶最適條件下按1.3.1進(jìn)行酶解。

表1 4種蛋白酶的最適酶解條件

(2) 單因素試驗(yàn)：選擇水解度最高的一種蛋白酶對(duì)影響水解度的4個(gè)因素(酶解溫度、酶解時(shí)間、酶底比和料液比)進(jìn)行優(yōu)化，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初始條件選取：酶底比0.3%、料液比1∶3 (g/mL)、酶解溫度45 ℃和酶解時(shí)間3 h。主要優(yōu)化條件：酶底比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)，料液比[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]，酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)，酶解時(shí)間(1，2，3，4，5 h)，各組試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

(3) 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以水解度指標(biāo)為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)顯著性影響因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)酶解工藝條件。

(4) 水解度的測(cè)定：采用TNBS法測(cè)定蛋白質(zhì)水解度。根據(jù)Adler-Nissen等[15-16]的方法，略作修改。以L-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取酶解上清液0.125 mL，加入1 mL pH 8.2，0.2 mol/L PBS和1 mL 0.1% TNBS，50 ℃恒溫避光反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后加入2 mL 0.1 mol/L HCl并振蕩使反應(yīng)完全終止，340 nm下測(cè)定吸光值。按式(1)計(jì)算水解度[17]。

(1)

式中：

K——水解度，%；

y——亮氨酸濃度，mmol/L；

B——樣品在340 nm下的吸光值；

A——去離子水在340 nm下的吸光值；

m——酶解樣品的質(zhì)量，g；

P——酶解樣品中的蛋白質(zhì)含量，g/g；

Htot——蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)，7.85 mmol/g蛋白質(zhì)。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 按GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法執(zhí)行。

1.3.4 氨基酸組成分析 采用氨基酸自動(dòng)分析儀。

1.3.5 抗炎活性評(píng)價(jià)

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞鋪板率大于培養(yǎng)瓶面積的80%時(shí)，吸盡原培養(yǎng)基，3 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，移液槍吸取培養(yǎng)液2 mL 吹打細(xì)胞至完全脫落，細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種至孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對(duì)細(xì)胞設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組：空白組以完全培養(yǎng)基孵育；模型組以1 μg/mL的LPS孵育；試驗(yàn)組以不同濃度的待測(cè)樣品加LPS(1 μg/mL)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

(2) MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率：采用MTT法評(píng)估樣品對(duì)細(xì)胞的毒性作用。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，按每孔100 μL將細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后吸盡原培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，試驗(yàn)組分別加入含不同質(zhì)量濃度的珍珠貝水解肽的完全培養(yǎng)基(0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL) 100 μL，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)并在培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT溶液后用PBS洗凈，每孔加入150 μL的DMSO完全溶解固體物質(zhì)，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下每孔的吸光值(A)，按式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)

式中：

S——細(xì)胞存活率，%；

A0——空白組吸光值；

A1——試驗(yàn)組吸光值；

A2——模型組吸光值。

(3) NO濃度測(cè)定：采用Griess法對(duì)RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量水平進(jìn)行測(cè)定。調(diào)整RAW264.7細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，每孔500 μL接種至24孔板，置于培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，吸盡原培養(yǎng)基，空白組和模型組加入500 μL完全培養(yǎng)基，試驗(yàn)組加入500 μL含不同濃度的珍珠貝水解肽的完全培養(yǎng)基(0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 mg/mL)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，吸盡原培養(yǎng)基并用PBS洗滌兩次，模型組和試驗(yàn)組每孔加入500 μL 1 μg/mL的LPS溶液，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，在96孔板按50 μL/孔中加入樣品上清液，各孔中分別加入50 μL Griess Reagent Ⅰ試劑和Griess Reagent Ⅱ試劑，震蕩混合均勻，于450 nm測(cè)定吸光值。

(4) ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子含量：按照ELISA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的各細(xì)胞因子含量。酶標(biāo)板上加入100 μL培養(yǎng)上清液，貼上封板膜后在37 ℃下避光孵育90 min，棄去液體，加入350 μL洗滌液，靜止30 s后棄去，在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。加入100 μL生物素抗體工作液，貼上封板膜后37 ℃避光孵育1 h，洗板5次。加入100 μL酶結(jié)合物工作液，貼上封板膜后37 ℃避光孵育30 min，洗板5次。加入100 μL顯色液，37 ℃避光孵育15 min后，加入100 μL反應(yīng)終止液，450 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算樣品中各細(xì)胞因子含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各試驗(yàn)進(jìn)行3次平行，數(shù)據(jù)取平均值。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件(IBM SPSS, USA)進(jìn)行單因素方差 (ANOVA)和Duncan法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可以看出，4種蛋白酶對(duì)貝肉的水解程度略有差異。由于酶的專一性，每種酶的酶切位點(diǎn)特定，酶解同一原料所得到的多肽，在肽序列、空間結(jié)構(gòu)和分子量大小等方面具有很大差異，導(dǎo)致水解度也不同[18]。中性蛋白酶對(duì)馬氏珠母貝肉水解程度最高，為13.09%，故選擇中性蛋白酶為最適蛋白酶。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶底比對(duì)蛋白水解度的影響 由圖2可以看出，隨著酶底比增大，水解度呈先增加后降低的趨勢(shì)，該結(jié)果與馬駿等[19]在制備啤酒抗氧化肽時(shí)的酶解效果相似，出現(xiàn)這種趨勢(shì)可能是由于酶底比小，底物與蛋白酶不能充分結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢；隨著酶底比增大，底物與酶的接觸率增加，反應(yīng)速度隨之加快；但當(dāng)酶與底物結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和后，過(guò)多的酶反而會(huì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制或酶自身相互水解，導(dǎo)致酶活力降低，影響體系反應(yīng)速度，水解度下降[20]。當(dāng)酶底比為0.3%時(shí)，水解度最高為13.58%，因此最適酶底比為0.3%。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 酶解溫度對(duì)水解度的影響 由圖3可以看出，隨著溫度的增加，水解度呈先增加后逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值為13.48%，酶解溫度達(dá)到45 ℃后水解度呈逐漸降低的趨勢(shì)。這是由于中性蛋白酶有其合適的反應(yīng)溫度范圍，溫度過(guò)高可能會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，破壞酶的特定空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低，酶解速度下降，進(jìn)而使水解程度下降[21]。因此，選擇45 ℃ 作為最適的酶解溫度。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 料液比對(duì)水解度的影響 由圖4可以看出，水解度因料液比的不同而差異明顯。水解度與料液比呈負(fù)相關(guān)，料液比的提高會(huì)使水解度不斷下降，由于料液比增大時(shí)，酶濃度被稀釋，單位體積內(nèi)酶含量降低，底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)變少，使酶解效果受抑制[22]，同時(shí)隨著料液比的提高，單位體積內(nèi)酶解出來(lái)的多肽濃度降低，從而導(dǎo)致水解度下降。當(dāng)料液比為1∶1 (g/mL)時(shí)，水解度最高，為16.15%。因此，選擇1∶1 (g/mL)為最適料液比。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖5可以看出，水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后逐漸平緩的趨勢(shì)，與劉東偉等[23]和張維等[24]的研究結(jié)果一致，酶解時(shí)間在1～2 h時(shí)對(duì)水解度的影響較為顯著，之后保持穩(wěn)定。這是因?yàn)槊附馇捌陔S著酶解時(shí)間的增加，酶更容易與底物接觸，水解度快速增長(zhǎng)，一定時(shí)間后，隨著底物濃度的降低，可水解的特定部位也隨之減少，水解度的增幅也隨之降低[25]。因此，選擇2 h為最適酶解時(shí)間。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取酶底比、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。以水解度為響應(yīng)值，酶底比、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量，分析馬氏珠母貝肉酶解的最優(yōu)工藝指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，從而得到3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=21.36+1.06A+0.72B-0.60C-0.53AB+0.61AC-0.62BC-1.98A2-2.02B2-0.55C2。

(3)

為檢驗(yàn)該回歸方程的有效性，對(duì)其進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型及方差分析?

由表4可知，回歸模型P<0.05，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相符；失擬項(xiàng)對(duì)應(yīng)的P=0.293 3>0.05，表明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小，方程可行。通過(guò)對(duì)回歸方程的顯著性分析可以看出，A對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P<0.05)，A2和B2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01)，由此可知試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，并且酶底比對(duì)水解度有極顯著影響。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 從圖6可以看出，酶底比和酶解溫度曲面坡度較大，酶解溫度在40～46 ℃時(shí)及酶底比在0.2%～0.3%時(shí)坡度更陡，之后趨于平緩，說(shuō)明酶解溫度的二次項(xiàng)和酶底比的二次項(xiàng)對(duì)水解度的影響顯著。酶解時(shí)間和酶底比、酶解時(shí)間和酶解溫度曲面均有一定的坡度，但酶解時(shí)間曲面坡度趨于平緩，說(shuō)明酶底比和酶解溫度對(duì)水解度的影響較大，酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響較小。

圖6 各因素之間交互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 6 Response surface diagrams for interaction of various factors

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)Design-Expert V8.06軟件分析得到的最佳酶解條件為酶底比0.32%、酶解時(shí)間1.38 h、酶解溫度46.27 ℃，在此條件下，水解度預(yù)測(cè)值為21.71%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最優(yōu)酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際因素，修正工藝參數(shù)為：酶底比0.32%、酶解時(shí)間1.4 h、酶解溫度46.3 ℃，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的水解度為(22.88±0.90)%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。因此，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取珍珠貝水解肽的酶解條件是可行的，回歸模型較可靠。

2.4 氨基酸組成分析

如表5所示，酶解物中氨基酸種類齊全，必需氨基酸(EAA)含量為19.84%。活性肽的功能活性與其特殊的氨基酸以及排列順序有關(guān)，具有抗炎活性的肽富含疏水性和帶正電的氨基酸，尤其是在N端或C端，其中疏水性高的氨基酸可促進(jìn)多肽與細(xì)胞膜之間的相互作用，并起到調(diào)節(jié)信號(hào)通路的作用，使多肽更容易進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮抗炎細(xì)胞活性，帶正電荷的氨基酸也與抗炎活性有關(guān)[26]。在珍珠貝水解肽中，有助提高抗炎能力的氨基酸包括疏水性氨基酸(21.19%)和帶正電荷氨基酸(10.45%)，占比34.65%，從物質(zhì)基礎(chǔ)層面表明珍珠貝水解肽可能具有抗炎方面的潛力。

表5 氨基酸組成分析?

2.5 珍珠貝水解肽抗炎活性

2.5.1 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的毒性 如圖7所示，在0.125～4.0 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各樣品均對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，且在0.125～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

2.5.2 對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響 如圖8所示，與空白組(C-)比較，LPS模型組(C+)的NO分泌顯著升高，表明抗炎細(xì)胞模型造模成功。與LPS模型組(C+)相比，添加不同質(zhì)量濃度珍珠貝水解肽處理組均能顯著降低造模細(xì)胞上清液中NO含量，且呈濃度依賴性，其中最高質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)處理組NO抑制率達(dá)70.00%。由此表明，珍珠貝水解肽可以有效降低炎癥細(xì)胞模型中的NO分泌，表現(xiàn)出顯著的抗炎活性。

2.5.3 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子分泌的影響

炎癥細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。當(dāng)病原體感染機(jī)體時(shí)，巨噬細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子來(lái)抵抗病原體的入侵。在某種程度上，細(xì)胞免疫因子的水平可用于評(píng)估免疫反應(yīng)[27]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

如圖9所示，與空白組(C-)相比，使用LPS誘導(dǎo)后的模型組(C+)細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌顯著上升，而使用不同多肽濃度處理組(0.125～2.0 mg/mL)干預(yù)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞炎癥因子分泌均被有效抑制，且均呈濃度依賴性，與NO釋放量的結(jié)果趨勢(shì)一致。其中最高質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)處理組能夠顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的釋放，抑制率分別為83.01%，85.04%，80.43%，由此表明，珍珠貝水解肽能有效降低由LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的分泌。

3 結(jié)論

以馬氏珠母貝肉為原料，以水解度為指標(biāo)篩選出中性蛋白酶為最佳用酶；基于單因素結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化確定了最優(yōu)工藝參數(shù)：酶解時(shí)間1.4 h，酶底比0.3%，酶解溫度46.3 ℃。在此基礎(chǔ)上得到的酶解物氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸含量為19.84%，有助于提高抗炎活性的氨基酸(疏水性氨基酸和帶正電荷氨基酸)占比達(dá)31.65%。通過(guò)對(duì)珍珠貝水解肽的體外細(xì)胞炎癥評(píng)價(jià)模型發(fā)現(xiàn)，珍珠貝水解肽能夠有效降低由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO和細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量，表明珍珠貝水解肽具有良好的抗炎活性。后續(xù)將對(duì)珍珠貝抗炎肽的活性成分及其抗炎機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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