6種益生菌及其添加方式對發酵米酒品質的影響

黃治國 蒲領平 任志強 程國富 鄧 杰

(1. 四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2. 四川宇晟酒業投資管理有限公司成都分公司，四川 成都 610000)

米酒是中國的傳統發酵酒。由于富含氨基酸、維生素、有機酸及礦物質等成分，米酒一直被當成一種滋補食品[1-2]。目前大多數新型米酒還處于研究和開發階段，能夠在市場中暢銷的并不多[3]。益生菌具有改善人體腸道菌群結構[4]、削弱致癌因子、降低膽固醇[5-6]、提高人體免疫力的功能[7-8]。隨著對益生菌保健功能的認識以及益生機理的不斷揭示，益生菌相關食品的開發成為目前食品領域的研究熱點。在米酒發酵中添加具有某些特性的益生菌，可提高其營養價值、改良其風味。

乳酸菌(LAB)是對人體健康有益的益生菌，多用于生產發酵乳制品[9-11]，而在酒類釀造中的應用較少。乳酸桿菌由最初的浸米過程中產生，到隨著酒曲的接入以及釀造過程中隨著米酒發酵條件變化而產生，乳酸桿菌在米酒的釀造過程中無處不在，其在米酒釀造過程中產生的乙酯類化合物則是米酒中重要的香氣物質[12]。因此，乳酸桿菌對米酒發酵具有重要影響。而目前將益生乳酸桿菌應用到米酒生產的研究鮮見報道。

研究擬探討6種益生菌乳酸桿菌(鼠李糖乳桿菌BV-77、干酪乳桿菌CS-773、發酵乳桿菌TSF-331、唾液乳桿菌AP-32、約氏乳桿菌MH-68、嗜酸乳桿菌TYCA-06)在只添加糖化酶、同時添加糖化酶和酵母以及不同的添加方式下對米酒發酵效果的影響，通過對益生菌菌粉與益生菌麩曲發酵米酒的酒精度、還原糖、總酸及感官評分結果進行對比，以期找到最適宜釀造米酒的益生菌，為生產優質新型米酒提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、麩皮：市售；

糖化酶：酶活力為 4萬U/g，江蘇博立生物制品有限公司；

酒精活性干酵母：成都醇中醇酒曲有限公司；

益生菌菌粉：鼠李糖乳桿菌BV-77、發酵乳桿菌TSF-331、唾液乳桿菌AP-32、約氏乳桿菌MH-68、嗜酸乳桿菌TYCA-06、干酪乳桿菌CS-773，安徽錦喬生物科技有限公司；

磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸、苯酚、檸檬酸氫二銨：分析純，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 主要儀器設備

生化培養箱：LRH-150-B型，廣東泰宏君科學儀器股份有限公司；

立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：CI54DS型，致微(廈門)儀器有限公司；

電熱恒溫培養箱：DH4000B2型，天津市泰斯特儀器有限公司；

干燥箱：LS-0610型，杭州樂乾科學儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1200型，上海翱藝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 益生菌麩曲制作 稱取50.00 g麩皮于500.00 mL三角瓶中，加入50.00 mL去離子水，滅菌后分別添加6種益生菌菌粉1.00 g，在28 ℃培養4～5 d，于40 ℃烘干并打碎，可制成相應的益生菌麩曲。

1.3.2 不同米酒的釀造工藝流程

操作要點：

(1) 糯米挑選：原料要求顆粒飽滿，無蟲蛀、無霉變、無其他雜質。

(2) 洗米、浸米：每份取300.00 g糯米，淘洗干凈后浸泡4～5 h，直到糯米可以揉碎即可。

(3) 蒸飯：用高壓蒸汽鍋蒸40.00 min左右。

(4) 淋冷：將蒸好的飯放于攤涼的容器中，加入70.00～80.00 ℃的熱水，邊拌邊淋，使米飯快速降溫至35.00 ℃左右，避免因緩慢冷卻導致微生物污染。

(5) 加菌加酵母：

益生菌麩曲米酒：益生菌麩曲添加量為0.80%，糖化酶用量為200 U/g，活化后加至米飯中，攪拌和勻。

益生菌菌粉米酒：添加益生菌菌粉1.00 g，200 U/g的糖化酶于米飯中攪拌均勻。

只在研究酵母對益生菌麩曲米酒或益生菌菌粉米酒的影響時，添加0.04%的酵母(以原料的干重計)，在釀造益生菌麩曲米酒和益生菌菌粉米酒時不添加酵母。

(6) 糖化發酵：將加曲后的糯米裝入發酵罐中，搭成喇叭型的凹窩，用保鮮膜密封發酵，置于28.00 ℃的培養箱中培養3 d。

(7) 過濾：用4層紗布過濾醪糟得到原液成品米酒，后續可用于理化分析和感官評價。

(8) 煎酒：60.00 ℃滅菌30.00 min。

1.3.3 理化指標測定

(1) 酒精體積分數：按GB/T 15038—2006的酒精計法執行。

(2) 還原糖：3, 5-二硝基水楊酸法[13]。

(3) 總酸：按GB/T 13662—2008的氫氧化鈉滴定法執行。

1.3.4 感官分析 采用定量描述分析法對益生菌米酒的香氣成分進行評價。感官培訓參照文獻[14-15]，選擇10位經過培訓的感官品評員(5男5女)在獨立的品評間進行品評，米酒的基本口感特征評價按照5點標度法，分別對酸、甜、苦、鮮和澀味打分，0～5分別表示感覺強烈程度逐漸增大，最終評分取平均值。

1.3.5 數據處理 每組試驗均重復3次，試驗結果均用“平均值±標準偏差”表示，用SPSS 22.0統計軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 益生菌米酒和益生菌麩曲米酒理化性質的比較

2.1.1 酒精含量 為了研究添加酵母對6種益生菌米酒和益生菌麩曲釀造米酒酒精含量的影響，結果發現添加酵母可顯著提高這兩種米酒的酒精含量。如圖1(a)所示，添加酵母后嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌釀制的米酒的酒精含量分別提高了24.39%，21.43%，18.85%；如圖1(b)所示，唾液乳桿菌、干酪乳桿菌麩曲釀制的米酒的酒精含量分別提高了33.33%，26.67%；而約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌麩曲釀制的米酒酒精含量僅提高了2.00%左右，可能因為這些菌種在發酵過程產生了乳酸及營養競爭等原因影響了酵母酒精發酵的過程[16]。

字母不同(只加糖化酶組：大寫字母;添加糖化酶和酵母組：小寫字母)表示不同益生菌米酒的差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同組米酒的差異顯著(P<0.05)

2.1.2 還原糖的比較 由圖2可知，加入酵母可提高米酒的還原糖含量；其中，鼠李糖乳桿菌釀制的米酒還原糖含量最多，顯著高于其他各組(P<0.05)，可能是因為鼠李糖乳桿菌能在短時間內降解原料中的淀粉產生更多的還原糖[17]。如圖2(b)所示：還原糖含量提高最多的是發酵乳桿菌麩曲釀制的米酒，提高了18.37%，而約氏乳桿菌麩曲釀制米酒的只提高了0.36%，可能是由于發酵時間較短，糖類還未轉化成酒精，導致不同益生菌對糖類轉化為酒精和有機酸的影響不同。

字母不同(只加糖化酶組：大寫字母;添加糖化酶和酵母組：小寫字母)表示不同益生菌米酒的差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同組米酒的差異顯著(P<0.05)

2.1.3 總酸含量的比較 由圖3可知，添加酵母后大部分米酒總酸含量均有所下降。添加酵母后，利用發酵乳桿菌釀制米酒的總酸含量下降最多，而唾液乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發酵乳桿菌麩曲釀制的米酒的總酸含量分別降低了12.06%，9.24%，6.20%。而約氏乳桿菌釀制米酒、干酪乳桿菌麩曲釀制米酒的總酸含量卻分別提高了7.84% 和7.54%，可能由于這兩種菌在發酵過程中能發酵碳水化合物產生乳酸，且具有良好的產酸特性以及抗逆性[18-19]。

字母不同(只加糖化酶組：大寫字母;添加糖化酶和酵母組：小寫字母)表示不同益生菌米酒的差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同組米酒的差異顯著(P<0.05)

2.2 益生菌添加方式對米酒發酵的影響

2.2.1 酒精含量 由圖4可知，在不同添加方式下得到的米酒酒精含量有所差異。除鼠李糖乳桿菌外，只添加糖化酶的益生菌菌粉釀造的米酒酒精含量高于益生菌麩曲的，可能是鼠李糖乳桿菌麩曲的糖化能力較強，使得原料中的淀粉酶解為還原糖的含量增加，導致發酵產生的酒精含量高[20]；與只添加糖化酶相比，酵母的添加可提高米酒酒精含量，并且添加益生菌菌粉比添加益生菌麩曲效果更好。研究[21]表明，釀造米酒酒精度一般在5.00%～14.00%vol，結合2.1.1發酵試驗，進一步證實了發酵乳桿菌菌粉、干酪乳桿菌菌粉、唾液乳桿菌菌粉更適宜釀造米酒。

字母不同(益生菌麩曲組：大寫字母;益生菌菌粉組：小寫字母)表示不同益生菌樣品之間差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同添加方式的米酒的差異顯著(P<0.05)

2.2.2 還原糖含量 由圖5(a)可知，益生菌菌粉釀造的米酒的還原糖含量總體上高于益生菌麩曲釀造的米酒；相比益生菌菌粉釀造的米酒，唾液乳桿菌、鼠李糖乳桿菌麩曲釀造米酒的還原糖含量有所提高，可能是因為麩曲的糖化能力加強使得原料中淀粉質的轉化率提高，進而在短時間內產生了更多的還原糖[22]；而其他菌種的還原糖含量卻有所下降，可能是糖類轉化成了甘油和有機酸。由圖5(b)可知，在相同的發酵條件下，鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、干酪乳桿菌菌粉釀造的米酒的還原糖含量顯著高于其麩曲釀造的(P<0.05)，其他幾種菌株相反。表明益生菌的加入對米酒的還原糖含量有一定影響，產糖的含量根據益生菌自身的特性而定。

字母不同(益生菌麩曲組：大寫字母;益生菌菌粉組：小寫字母)表示不同益生菌樣品之間差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同添加方式的米酒的差異顯著(P<0.05)

2.2.3 總酸含量 如圖6(a)所示，在只加糖化酶的條件下，益生菌菌粉釀造的米酒總酸含量均有顯著差異(P<0.05)；添加唾液乳桿菌菌粉米酒的總酸含量最高(14.30 mL/L)，而約氏乳桿菌麩曲米酒的總酸含量最低(9.20 mL/L)。如圖6(b)所示，同時添加酵母和糖化酶時，不同添加方式下米酒的總酸含量均有所提高，可能是酵母菌呼吸作用產生的二氧化碳促進了同一環境下乳酸桿菌的生長[23]，乳酸桿菌進一步通過戊糖磷酸途徑產生乳酸[24]，導致總酸含量增加；添加發酵乳桿菌菌粉米酒的總酸含量最低(8.40 mL/L)，且在口感上酸甜適口；結合上述發酵試驗結果來看，發酵乳桿菌菌粉在同時加糖化酶和酵母的添加方式下釀出的米酒最佳。

字母不同(益生菌麩曲組：大寫字母;益生菌菌粉組：小寫字母)表示不同益生菌樣品之間差異顯著(P<0.05)；“*”表示同種益生菌不同添加方式的米酒的差異顯著(P<0.05)

2.3 感官評價

分別對酒樣的酸、甜、苦、鮮、澀5種主要口感特征進行強度打分，不同種類益生菌發酵的米酒感官評價雷達圖見圖7。各米酒樣品的口感特征差別較大，發酵乳桿菌與嗜酸乳桿菌釀制米酒的各項評分均較為接近，唾液乳桿菌和約氏乳桿菌的感官得分較低，可能與釀造條件有關，導致給米酒風味造成負面影響?？傮w來看，采用發酵乳桿菌發酵米酒時酒體自然清香，無異味，甜酸適口，醇正綿和，具米酒特有的風味。因此，確定發酵乳桿菌為開發益生菌米酒的最佳菌種。

圖7 感官分析雷達圖Figure 7 Radar map of sensory analysis

3 結論

研究了添加酵母及不同益生菌添加方式對米酒品質的影響，通過對米酒的酒精度、還原糖、總酸和感官評分進行比較分析，得出添加1.00 g發酵乳桿菌菌粉、0.04%酵母和200 U/g糖化酶釀造的米酒效果最好，其酒精度為7.20%vol，還原糖含量為270.00 mg/mL，總酸含量8.40 mL/L，且口感較濃郁。乳酸桿菌與酵母混合發酵能提高食品的益生特性，其中添加發酵乳桿菌的益生菌酸奶的感官得分很高。后期可對發酵乳桿菌的性能及在米酒發酵工藝中的應用進一步研究驗證。