流式細胞術在乳品微生物檢測中的應用

祁 巖 游春蘋

(1. 乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2. 上海乳業生物工程技術研究中心，上海 200436；3. 光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436)

乳是理想的天然食品之一。它包括多種品類，例如液態乳、發酵乳制品(如酸奶和奶酪)和經干燥提煉后的乳制品(如奶粉和煉乳)[1]。乳品中可能存在多種微生物，有影響產品質量和消費者健康的腐敗菌和致病菌，也有可以改善乳品發酵工藝和功能性的益生菌。鑒于微生物對乳品的影響，目前乳品微生物檢測越來越受到關注。

現階段，常用的乳品微生物檢測技術包括傳統計數法、免疫分析檢測技術、PCR技術、ATP生物熒光技術和基因芯片技術等[2-3]。這些技術在乳品微生物檢測方面各有優勢，也各有不足之處，如傳統計數法檢測成本低、操作簡單，但檢測時效長。傳統PCR技術快速、簡單，但無法區分死活細胞。

流式細胞術是應用流式細胞儀，對懸浮單細胞進行快速定量分析和分選，是集電子技術、激光技術和計算機技術于一體的先進的生物學測定技術，具有高靈敏度、高通量、高精確度和多參數檢測等多個功能特征[4-5]。流式細胞術起初應用在醫學臨床檢驗領域，隨著科技的發展和儀器不斷的改進與完善，目前該技術已被應用于分子生物學、免疫學、病毒學、癌癥生物學、傳染病監測和食品檢測等多個學科[4,6]。

近年來，流式細胞術在乳品微生物檢測領域發揮了廣泛的作用。文章擬結合國內外相關研究，探討流式細胞術在乳品微生物檢測方面的進展，旨在為流式細胞術在乳品領域中進一步的開發提供參考。

1 流式細胞術

1.1 流式細胞術的發展

流式細胞術最早可追溯到20世紀30年代。1934年，Moldaven提出了流式細胞儀的概念原型，他設想讓細胞檢測自動化，并使光電記錄儀記錄通過單根毛細管的細胞數量。1949年，Coulter提出了在懸液中計數粒子的方法。1953年，Parker和Hutcheon描述了全血細胞計數裝置，是流式細胞儀的雛形。1967年，Kamemtsky和Melamed提出了細胞分選方法。1969年，Van Dilla Fulwyler等發明了第一臺熒光檢測細胞儀。20世紀70年代，流式細胞術開啟了商業化進程，一批生產流式細胞儀的公司如Becton Dickinson和Beckman Coulter逐漸涌現；90年代開始，流式細胞術邁向了低成本、易操作、多用途、高精尖的發展歷程。迄今為止，流式細胞術的發展已日臻完善，研究人員越來越側重于檢測樣品的制備、軟件開發等方面，以擴大流式細胞術在不同領域的應用范圍[7-8]。

1.2 流式細胞儀的工作原理和結構

流式細胞儀的基本工作原理是利用激光對鞘液中的染色細胞標志物進行測量，并記錄其熒光寬度、熒光強度和散射光強度等參數[8]。傳統的流式細胞儀主要由液流系統、光學系統和電子系統三部分組成(圖1)。液流系統包括液流驅動系統和流動室。液流驅動系統主要提供壓力和進行壓力調節。細胞懸液在壓力作用下進入流動室，同時被加壓后的鞘液也自鞘液管進入流動室，在鞘液的包被下，細胞懸液由流動室的噴嘴噴出形成細胞液柱。光學系統包括激發光源和光束收集系統。細胞液柱在激發光的照射下，產生熒光信號和散射光信號，之后，光束收集系統中的濾光片將熒光信號引導至特定檢測器。電子系統將來自檢測器的信號經過放大和模數轉換使其成為計算機可以讀取的數字信號，該信號被送至計算機，經過數據處理和分析得出結果。值得一提的是具有分選功能的流式細胞儀還包括了分選系統。細胞的分選是指將待測液滴給予不同電荷，使其在高壓電場作用下發生偏轉，落入指定的收集容器內，實現細胞的分離[6,10-12]。

圖1 流式細胞儀結構示意圖[9]Figure 1 Schematic diagram of flow cytometer

2 流式細胞術檢測乳品微生物的方法

應用流式細胞術檢測乳品中微生物需要經過樣品前處理、樣品染色、流式細胞儀測定等過程。樣品前處理方法、緩沖液的選擇、熒光染料的選擇等都會影響檢測結果的準確性。

2.1 樣品前處理

乳及乳制品中含有豐富的乳蛋白和乳脂肪等物質，在使用流式細胞儀檢測前，需要經過一定的樣品前處理以減少背景干擾。針對非液態乳品，需要將其轉化為液體基質進行后續研究。Wang等[13]將奶粉溶于緩沖蛋白胨水中制成液相。Yanachkina等[14]采用液壓奶酪壓榨機將磨碎的奶酪擠出奶酪汁備用。針對液態乳品，通常的做法是將樣品用紗布過濾去除雜質，用蛋白酶降解蛋白質，加入TritonX-100以破碎牛乳體細胞，通過離心實現脂肪分離[15-17]。除了用通常的樣品前處理方法，劉思淵等[16]還采用牛奶中微生物快速純化試劑盒處理樣品，該試劑盒可直接去除牛奶中的脂肪和蛋白質顆粒，使樣品純化時間由傳統的30 min縮短至15 min。

2.2 緩沖液的選擇

樣品經過前處理后得到細胞懸液。細胞懸液需要用緩沖液稀釋，緩沖液中的陽離子含量可影響染色質量和檢測結果。Sahalan等[18]和Kathrin等[19]均發現緩沖液陽離子缺乏可影響大腸桿菌(Escherichiacoli)細胞膜的穩定性和活力，進而影響熒光信號，因此，建議用Mg2+和Ca2+來補充緩沖液。Haruta等[20]研究表明使用標準緩沖液，經過流式細胞儀分析僅可檢測到低于30%的大腸桿菌和低于40%的鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)陽性信號，而向標準緩沖液中添加Ca2+后，大腸桿菌陽性信號檢出可達90%以上，鼠傷寒沙門氏菌陽性信號檢出可達80%以上。Kathrin等[19]還用磷酸緩沖鹽溶液、M9緩沖鹽溶液和Tris-HCl分別培養大腸桿菌，應用流式細胞儀進行檢測，對比3種緩沖液對熒光信號的影響，發現磷酸緩沖鹽溶液更適宜用于稀釋。目前在乳品微生物檢測中大多應用未補充陽離子的磷酸緩沖鹽溶液，可建議在緩沖鹽溶液中適當添加陽離子以提高檢測質量。

2.3 熒光染料的選擇

流式細胞術對乳品中微生物的定量以及活性的檢測依賴于熒光染料。染料穩定性、染色強度等均影響染料作用效果[21]。表1列舉了乳品微生物檢測時常用的染料種類及原理。根據不同檢測目的，可選擇不同染料品類。孫芝楊等[15]選用PI染料定量乳品的細菌總數。劉思淵等[16]用偶聯有熒光染料FITC的細菌單克隆抗體對大腸桿菌O157:H7進行特異性標記，通過流式檢測方法，快速定量牛乳中的大腸桿菌O157:H7。He等[25]采用SYTO9和PI兩種染料雙色聯用研究乳品中乳酸菌(Lactic acid bacteria)的存活情況。經過染色后，流式細胞儀可通過檢查熒光信號強度定量細胞總數或對細胞的死活以及損傷狀態等方面進行判斷。

表1 乳品微生物檢測常用的熒光染料

3 流式細胞術在乳品微生物檢測中的應用

3.1 乳品質量安全方面的應用

目前乳品行業發展迅速，微生物引發的乳品質量安全問題也愈發凸顯。微生物檢測是監控乳品質量安全不可缺少的一個環節?，F階段，在乳品工業中，乳品微生物檢測一般采用計數法，該方法需要對細菌進行增菌、培養等一系列步驟，耗時較長。多數乳品的保質期較短，需要盡快銷售，所以當在實驗室完成檢測時，產品可能已經銷售掉了。因此，需要進行乳品中微生物的快速且準確檢測，幫助生產者對乳品質量實施在線控制并及時規避風險。流式細胞術可對乳品中的細菌總數及活菌數進行快速定量和鑒定。孫芝楊等[15]用流式細胞術可在1 h內測得液態乳中細菌總數。Liu等[32]應用流式細胞儀通過高選擇性熒光標記抗體和PI定量奶粉和液態奶中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)活菌數，可在6 h內(包括5 h增菌過程)檢測出金黃色葡萄球菌，在奶粉和液態奶中的檢出限分別為8.30，7.50 mL-1。Wnuk等[29]應用成像流式細胞儀(Imaging flow cytometry, IFC)結合AO染料，同時應用多個IFC參數進行表征，成功且快速地篩選出牛奶中的8種細菌。表2為應用流式細胞儀快速檢測乳品中微生物的相關參數，對比費時耗力的平板計數法，運用流式細胞術檢測效率得到了極大提高，有助于乳品質量的保障。

表2 乳品微生物流式檢測的相關系數

在乳品的有害菌中，還存在著一類活的非可培養態(Viable but non-culturable, VBNC)微生物，其引發的安全風險不容忽視。VBNC意為微生物在不良環境下進入異常的生理狀態，它們具有代謝活性，卻不能被培養或進行繁殖，但在某些特殊復蘇條件下，可恢復正常生理狀態[35-36]。在乳品加工中，存在著諸多環境脅迫因素，例如低pH、低水分活度和抗生素，它們都可以誘導微生物進入VBNC狀態，使其在常規微生物檢測中不能被發現。同時，還有研究[37]表明VBNC態的微生物比可培養態的微生物對抑菌物質具有更大的耐受性。因此，鑒別VBNC態微生物在乳品質量安全領域具有實用價值。運用流式細胞術可通過細胞形態或生理情況等判斷乳品中的VBNC態微生物[38-39]。Zhang等[39]應用流式細胞術等方法研究了用于奶牛疾病治療的氨芐青霉素誘導阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)進入VBNC態的能力。阪崎克羅諾桿菌是污染奶粉的主要病原菌之一，它可對免疫力低下人群尤其是嬰幼兒健康產生危害。Zhang等[39]研究發現了104～105mL-1不可培養的活細菌，這些細菌可以在適宜條件下復蘇，其形態較正常細胞不同，具有呼吸鏈活性，判斷細菌進入了VBNC狀態，及時避免了抗生素誘導的VBNC態阪崎克羅諾桿菌可能造成的健康風險。目前，國內外應用流式細胞儀評估乳品中VBNC態有害微生物的研究相對較少，仍需要進一步豐富。

流式細胞術還可以通過檢測乳品中有害微生物的生理狀態快速評估加工工藝和抑菌物質的抑菌效果。Li等[40]應用流式細胞術和平板計數法對比了微波容積加熱與傳統的管式換熱對脫脂牛奶中原生細菌和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)及其內生孢子的滅活作用。兩種檢測方法均證明了微波容積加熱與管式換熱以相似的程度滅活了細菌和內生孢子。相比平板計數法，運用流式細胞儀檢測速度較快，還可提供細胞滲透性等一系列生理數據，這些數據可以整合到未來乳品質量控制和風險評估策略中。Mieszkin等[41]使用乳酸菌作為生物保護培養物防止發酵乳中酵母的腐敗，應用流式細胞術評估了酵母活力、膜電位、細胞內pH和活性氧的產生，提供了乳酸菌抗真菌機制的信息，為防止乳制品真菌腐敗的柵欄技術選取提供更多理論依據。

3.2 乳品發酵方面的應用

對乳酸菌進行定量分析是評估發酵劑和發酵乳制品質量的重要因素。中國制定了GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》，規定乳酸菌數≥1×106CFU/mL(或 CFU/g)。益生菌常被加入發酵乳及乳飲料中，其菌種的生長和存活可以改善乳品發酵工藝和提高乳品的功能性。2015年12月，國際標準化組織(International Standard Operation, ISO)制定了標準化方法ISO19344:2015，介紹了用流式細胞儀分析乳制品發酵劑中乳酸菌和益生菌的活性和總量。目前，已有研究人員采用流式細胞術對乳酸菌和益生菌展開了活細胞快速定量分析。杜耿記等[42]采用流式細胞儀對29種市售酸奶中的乳酸菌進行了快速定量檢測，與傳統的國標檢測方法(GB 4789.35—2010)數據相近，且培養時間由48 h縮短至13 min，極大提高了檢測速度。王杰等[43]通過流式細胞術對發酵乳飲料和發酵乳中的乳酸菌快速檢測，檢測結果與平板計數法具有較好的相關性，且單樣品檢測時間不超過10 min。Chiron等[44]應用流式細胞術結合多克隆抗體針對5種不同物種的益生菌進行了計數、鑒定和活力評估研究，該檢測方法僅耗時2 h。

除了對發酵菌種進行快速定量檢測外，流式細胞術還可檢測發酵細菌的生理狀態。Yanachkina等[14]采用流式細胞儀研究了不同鹽分和脂肪含量在切達奶酪成熟過程中對發酵劑中細菌生理狀態的影響，發現鹽和脂肪水平的變化會影響發酵劑中細胞的自溶、透化以及細胞內酶釋放等性能。Poudel等[27]運用流式細胞儀研究了奶酪發酵劑中細菌在奶酪貯藏過程中的存活情況，發現奶酪中約5%的總發酵劑培養細胞在貯藏6 d后死亡，另外3%～19%的細胞被認定為具有半透性的活細胞，它們具備代謝活性，可釋放細胞內酶進入奶酪，促使奶酪貯藏中風味物質的形成，由此可見，鑒定發酵菌細胞的生存狀態對于評估乳制品的風味具有重要意義。

4 結語與展望

流式細胞術在乳品微生物檢測領域已有一定的應用與發展，但仍存在一些不足。檢測方法方面：① 流式細胞儀價格昂貴，檢測樣品的制備和數據的分析都需要專業人員完成。目前，流式細胞儀大多在科研機構和醫學領域應用，較難在工業界推廣。② 乳品樣品的前處理方法仍有待開發和完善。液態乳、發酵乳、奶粉和奶酪已有相關前處理方法，但主要是針對蛋白質和脂肪的去除，消除其他乳品成分造成的背景信號干擾的相關研究仍較為缺乏。檢測項目方面：檢測項目較為單一，目前，多數研究圍繞乳品中微生物快速定量或生理狀態展開，研究內容有待進一步拓展。

針對上述不足，流式細胞術可以從以下方面發展。檢測方法方面：① 使流式細胞儀便攜化，目前智能手機類似于微型計算機，具有通信、拍照、信息處理和加工等功能，可將智能手機上設定檢測分析程序，遠程對檢測結果進行分析。② 開發新型的智能化算法，使數據分析更為方便，同時也節約了人員培訓的成本。③ 進一步挖掘樣品前處理技術，盡最大可能減少不同種類乳品造成的背景干擾。檢測項目方面：① 應用流式細胞儀檢測乳品加工管道中生物膜。生物膜可附著于管道、機械等地方，它可以對抗菌物質進行理化防御，降低抑菌效率。與浮游細菌相比，細菌生物膜更難以應付[45-46]。因此，尋求快速量化該類菌體的方法顯得至關重要。目前運用流式細胞儀檢測乳品微生物的研究仍基本圍繞浮游微生物展開，乳品管道內生物膜檢測仍需補充。② 進一步開發特異性抗體，鑒別不同種類甚至不同品系的菌種，為乳品中微生物的快速溯源提供有效支持。③ 將流式細胞術與組學技術相結合，通過流式細胞術可獲得細菌表現型信息，組學技術可獲得基因相關信息，更加清晰地了解乳品中微生物的生理狀態。

總之，乳品微生物檢測一直是乳品工業界關注的熱點。流式細胞術具有檢測速度快，可鑒定細胞存活狀態等優點，在乳品領域應用越來越廣泛。隨著時代的進步，流式細胞術也在不斷地更新迭代，流式細胞術在檢測中存在的問題也將會被一一解決。