芪蛭通脈顆粒對冠狀動脈粥樣硬化模型大鼠的干預作用機制研究※

宋欠紅 樊 睿 李 易 李戈媛 葉 勇 趙 淳

(云南中醫藥大學第一附屬醫院心血管病科，云南 昆明 650021)

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的重要病理變化之一，可隨著年齡增長而加重[1]。動脈粥樣硬化是多種因素引起的慢性、彌漫性、漸進性炎癥病變，是血管壁對多種損傷的異常反應，具有變性、增殖的典型炎癥特點[2-3]。芪蛭通脈顆粒是我們根據益氣活血通絡法結合云南民族醫藥創制的治療冠心病的經驗方，前期研究表明芪蛭通脈顆粒對冠心病胸悶、胸痛、氣短及血脂異常均有很好療效[4-5]。為進一步研究芪蛭通脈顆粒治療冠心病的作用機制，本研究通過觀察芪蛭通脈顆粒對冠狀動脈粥樣硬化大鼠冠狀動脈組織Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)蛋白表達及血清白細胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-10水平的影響[6-8]，探討芪蛭通脈顆粒治療冠心病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量240～280 g，自由飲水進食，飼養溫度(20±2)℃，濕度25%～60%，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(滇)2018-0003，大鼠合格證號：430067000011726。

1.2 實驗藥物 芪蛭通脈顆粒(藥物組成：炙黃芪20 g,水蛭粉3 g,紅曲6 g，燈盞細辛15 g，三七6 g，均采用中藥顆粒劑，四川新綠色藥業科技發展有限公司提供)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20051408)；垂體后葉素注射液(上海禾豐制藥有限公司，國藥準字H31022751)。

1.3 主要實驗試劑與儀器 IL-6、IL-8及IL-10酶聯免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)；TLR4及NF-κB蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；兔源TLR4/NF-κB抗體(美國Cell signaling technology公司)；電子分析天平(德國Sartorius公司)；凝膠成像設備(美國BIO-RAD公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模與分組 所有大鼠適應性飼養1周后，隨機分為空白對照組、模型組、阿托伐他汀鈣組及芪蛭通脈低、中、高劑量組，每組10只。參照相關文獻[9-10]制作大鼠冠狀動脈粥樣硬化模型。除空白對照組外，其余各組均給予高脂飼料(87.3%基礎飼料，2%膽固醇，10%豬油，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶)喂養8周(56 d)，按5 g/kg灌胃，每日1次，空白對照組給予5 mL/kg蒸餾水灌胃。其中從第53 d開始，模型組、阿托伐他汀鈣組及芪蛭通脈低、中、高劑量組給予垂體后葉素注射液3 U/(kg·d)腹腔注射，連續給藥3 d。第3次注射完畢后30 min內進行心電圖檢測，若肢體導聯ST段抬高超過0.1 mV，或有T波高聳，則視為造模成功[11]。

1.4.2 給藥方法 于第9周開始藥物干預，實驗動物與成人用藥量的換算方法：人用量×0.0026×50=大鼠用量/kg體質量[12]。芪蛭通脈低、中、高劑量組分別按6.5、13、26 g/(kg·d)給予芪蛭通脈水溶液灌胃，阿托伐他汀鈣組按13 mg/(kg·d)給予阿托伐他汀鈣水溶液灌胃，空白對照組按5 mL/kg給予蒸餾水灌胃。各組均連續灌胃4周。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 血液指標 各組均連續灌胃4周后，予以腹腔內注入10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，然后將大鼠四肢、頭部固定，仰臥位，0.22%碘伏消毒皮膚，切開腹壁組織，暴露腹主動脈，在腹主動脈處采動脈血5 mL，1 500 r/min離心15 min后，取上清液置于-20 ℃冰箱保存備用。采用ELISA法檢測血清IL-6、IL-8及IL-10水平，嚴格按照操作說明書進行。

1.5.2 心肌組織指標 各組大鼠抽血完畢后，打開胸腔，充分暴露并取下心臟，采用Western blot法檢測心肌組織TLR4及NF-κB蛋白相對表達情況[13-14]。摘取前降支、回旋支、右冠狀動脈等冠狀動脈組織，每只大鼠取3 mm×3 mm，用眼科剪剪碎，放置于10 mL離心管中，加入裂解液，勻漿器充分勻漿，使其充分裂解，轉移至1.5 mL EP管中，4 ℃，1200 r/min離心15 min，取上清液，保存于-80 ℃環境中。然后按照Western blot法操作說明書進行，以GAPDH內參，得出待測蛋白的條帶后，用凝膠成像分析系統掃描蛋白條帶后進行光密度分析，計算相對表達量。

2 結果

2.1 造模情況 造模后，各組大鼠活動減少，飲水減少，毛色光澤度下降，其中模型組大鼠死亡2例，芪蛭通脈中劑量組大鼠死亡1例，其余大鼠均造模成功。

2.2 各組大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比較 與空白對照組比較，模型組血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)。與模型組比較，芪蛭通脈中、高劑量組血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脈高劑量組IL-10水平升高(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組、芪蛭通脈低劑量組IL-6、IL-8、IL-10水平及芪蛭通脈中劑量組IL-10水平與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。芪蛭通脈3個劑量組組間比較，芪蛭通脈高劑量組血清IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)、IL-10水平高于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)，IL-8水平低于芪蛭通脈中劑量組(P<0.05)，芪蛭通脈中劑量組IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比較

2.3 各組大鼠冠狀動脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達比較 與空白對照組比較，模型組冠狀動脈組織TLR4、NF-κB相對表達升高(P<0.05)。與模型組比較，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動脈組織TLR4、NF-κB相對表達均降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組僅NF-κB相對表達降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組TLR4相對表達與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。芪蛭通脈3個劑量組組間比較，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動脈組織TLR4、NF-κB相對表達組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠冠狀動脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達比較

注：A空白對照組；B模型組；C阿托伐他汀鈣組；D芪蛭通脈低劑量組；E芪蛭通脈中劑量組；F芪蛭通脈高劑量組圖1 各組大鼠冠狀動脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達情況

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病發生的獨立危險因素，其特點是動脈管壁增厚、變硬，失去彈性和管腔縮小，由于在動脈內膜上積聚的脂質外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。隨著社會經濟水平的發展，人們飲食結構發生了變化，高油、高鹽、高糖飲食，運動量不足，工作壓力大，使動脈粥樣硬化發病率逐年增加。TLR4/NF-κB是人和大鼠動脈粥樣硬化過程中重要的信號通路。NF-κB是TLR下游的重要因子，參與動脈粥樣硬化的各個階段，能夠反映動脈粥樣硬化的進程，在其形成過程中發揮重要的作用[15]。研究表明，斑塊不穩定和斑塊破裂可使TLR4/NF-κB信號通路高表達[16]。IL-6是人體重要的促炎因子，主要由單核-巨噬細胞、血管內皮細胞、T淋巴細胞等合成分泌，在血液中廣泛存在，IL-6與受體結合后，可誘導多種細胞分化、成熟和凋亡，是動脈粥樣硬化及血管炎性反應過程中的獨立危險因素[17]。IL-8作為典型的炎癥趨化因子，在動脈粥樣硬化發生發展過程中具有重要作用，其可能作用機制包括:①促進單核細胞與內皮細胞黏附，促進平滑肌細胞增殖和遷移，參與早期動脈粥樣硬化斑塊的形成；②誘導中性粒細胞到達已受損的血管內皮，啟動凝血系統的級聯反應，促使斑塊破裂出血[18-19]。IL-10是重要的抗炎因子，可以減少細胞凋亡，抑制巨噬細胞活化，也抑制活化基質金屬蛋白酶(MMPS)和炎癥因子生成，在抑制促炎細胞因子產生的同時增加自身表達，下調黏附分子表達，減少脂質堆積[20]。

冠心病屬中醫學胸痹、胸痛等范疇，瘀血阻絡是其發生的主要病因病機。平素嗜食膏粱厚味，損傷脾胃，助濕生熱，熱耗津液，導致心脾氣虛，運化失常，轉化為痰濁脂液，導致氣血受阻，氣機運行不暢，氣結血凝，瘀血阻絡，心脈痹阻，而發生胸痛。芪蛭通脈顆粒正是根據瘀血阻絡的病因病機擬定的治療冠心病的經驗方，方中黃芪補氣升陽，行滯通痹，為君藥；水蛭破血通泄，逐瘀力強,三七活血化瘀而不傷正，兩者共為臣藥；紅曲健脾化痰，為佐藥；燈盞細辛活血通絡止痛，為使藥。全方共奏益氣活血、化瘀通絡之效?，F代藥理研究亦表明，黃芪可提高免疫力，改善心功能，并有抗衰老作用[21]；水蛭有較強抗凝血作用[22]；三七主要含有人參皂苷和三七皂苷，具有降低心肌耗氧量、改善心肌氧利用率、抗動脈粥樣硬化等作用[23]；紅曲可加速膽固醇代謝，保護血管內皮，改善內皮功能[24]；燈盞細辛為云南民族藥，可以改善血液流動，具有保護血管內皮作用[25]。

本實驗研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)，冠狀動脈組織TLR4、NF-κB相對表達升高(P<0.05)，提示模型組在冠狀動脈粥樣硬化進程中出現明顯的炎性反應，TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4、NF-κB蛋白表達明顯升高。與模型組比較，芪蛭通脈中、高劑量組血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脈高劑量組IL-10水平升高(P<0.05)，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動脈組織TLR4、NF-κB相對表達均降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組僅NF-κB相對表達降低(P<0.05)，其中芪蛭通脈高劑量組對血清IL-6、IL-8水平改善均優于芪蛭通脈低、中劑量組(P<0.05)。提示經相應灌胃治療后各組大鼠的炎性反應和TLR4/NF-κB信號通路激活情況均有一定抑制，其中芪蛭通脈高劑量組的治療效果更佳。

綜上所述，芪蛭通脈顆粒對冠狀動脈粥樣硬化大鼠治療作用確切，其作用機制可能與調控TLR4/NF-κB信號通路，抑制炎性反應有關，但其有效劑量及明確的量效關系有待進一步深入研究。