HILIC-MS/MS法檢測動物源運動營養品中9種抗病毒藥物殘留

郭 巍

(焦作大學，河南 焦作 454000)

抗病毒藥物是一類用于預防和治療人和動物病毒感染的藥物，常用的有阿昔洛韋、奧司他美金剛、奈韋拉平等[1-2]。由于抗病毒藥物對畜禽的病毒性流感有一定的預防和治療作用，且價格低廉，所以也常被用于畜禽養殖業[3-4]。但因缺乏相應的科學規范以及安全可靠的數據支持，將人用抗病毒藥物移作獸用，會在動物體內造成藥物殘留，還可能會使病毒菌株發生變異，危害人類健康[5-6]。但是對抗病毒藥物多組分的檢測方法尚不完善，為了防止通過食物鏈引起中毒，尤其是動物源性運動營養品這類特殊食品，有必要建立一種快速檢測這些目標組分的方法，加強動物源性運動營養品中抗病毒藥物殘留的監控。

運動營養品對產品的安全性要求較高，市場上以動物源為基質的運動營養品品種繁多，所占市場份額也越來越大。近年來，食品中獸藥殘留事件頻頻曝光，所以人們對這類特殊食品中的藥物殘留越來越重視，而抗病毒藥物殘留是研究的熱點[7-9]。目前食品中抗病毒藥物殘留的檢測方法主要有酶聯免疫法[10-12]、高效液相色譜法[13-14]、液相色譜—串聯質譜法[15-16]等。酶聯免疫法由于儀器精度所限，檢測靈敏度較低；高效液相色譜法較為常用，但是對于極性組分相近的物質，分離度較差；高效液相色譜—串聯質譜法流動相中要使用離子對試劑，存在系統穩定性差以及抑制待組分電離的問題。親水交互作用色譜(Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC)是一種組分分離模式介于正相色譜和反相色譜之間的色譜技術，適用于分析強親水性和強極性化合物，可解決樣品中多種強極性組分分離難的問題[17-18]。目前，親水交互作用色譜法在農產品抗病毒藥物檢測方面的應用較多，而對運動營養品中抗病毒藥物檢測方面的研究較少。研究擬通過固相萃取凈化技術，結合親水色譜分離技術對強極性較難分離的9種抗病毒藥物組分進行提取，通過親水交互作用色譜—串聯質譜法(HILIC-MS/MS)檢測動物源運動營養品中9種抗病毒藥物組分的殘留，以期為動物源運動營養品中抗病毒藥物殘留的分析和監控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效液相色譜—串聯質譜儀：Xevo TQ-S型，ZIC-HILIC色譜柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，美國Waters公司；

InertSustain Amide色譜柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)、TSKgel Amide-80色譜柱(3.0 mm×150 mm，2 μm)：日本島津有限公司；

Obelisc R色譜柱：4.6 mm×150 mm，5 μm，美國Sielc科技公司；

奈韋拉平(98.5%)、泛昔洛韋(99.2%)、阿比多(99.0%)、阿昔洛韋(99.0%)、咪喹莫德(99.5%)、美金剛(99.0%)、金剛烷胺(98.5%)、奧司他韋(99.2%)、嗎啉胍(98.5%)標準品：上海安譜實驗科學科技有限公司；

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

MCX、MAX以及PRiME HLB固相萃取小柱：100 mg/3 mL，美國Waters公司；

動物源運動營養品(雞胸肉源蛋白棒、牛肉源蛋白棒、乳清蛋白棒、雞胸肉運動代餐粉、牛肉運動代餐粉、蛋白運動能量棒)：市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件優化 參照文獻[19-20]，選擇4種色譜柱ZIC HILIC色譜柱(鍵合相為硅膠)、InertSustain Amide色譜柱(鍵合相為酰胺基)、TSKgel Amide-80色譜柱(鍵合相為酰胺基)以及Sielc Obelisc R色譜柱(鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團)，比較9種抗病毒藥物組分的分離效果。

1.2.2 質譜條件 采用正離子電離模式掃描；監測模式為多反應監測模式；離子源溫度 200 ℃；脫溶劑氣流量20 L/min；錐孔氣流量2.0 L/min。

1.2.3 儀器條件 Obelisc R色譜柱，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量2.0 μL；流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈，按表1進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫步驟

1.2.4 樣品前處理 稱取混合均勻的樣品(固體樣品預先粉碎)2.0 g，加入20 mL提取液(分別比較乙酸銨緩沖溶液、三氯乙酸溶液，偏磷酸—甲醇溶液，乙酸—乙腈溶液4種提取液)，渦旋30 s，使樣品與提取液混合均勻，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min，過濾，取5.0 mL濾液上樣，選擇3種固相小柱(MCX、MAX以及PRiME HLB)，固相萃取過程按照固相小柱操作步驟分別經活化、上樣、淋洗、洗脫后收集濾液，過0.22 μm濾膜后上機檢測。

1.2.5 標準曲線繪制 稱取適量的9種抗病毒藥物組分標準品，用甲醇超聲溶解并配制成1 000.0 ng/mL的儲備液，檢測前以流動相配制成0.1～50.0 ng/mL質量濃度范圍的標準混合溶液，經儀器進行分析，繪制標準曲線。

1.2.6 提取溶液的選擇 參照文獻[21-22]，提取含50 μg/kg 陽性樣品的目標組分，比較提取溶液Ⅰ：20 g/L乙酸銨溶液，提取溶液Ⅱ：1%乙酸溶液，提取溶液Ⅲ：1%乙酸—甲醇溶液(V乙酸∶V甲醇為9∶1)，提取溶液Ⅳ：1%乙酸—乙腈溶液(V乙酸∶V乙腈為9∶1)對9種組分提取的影響。

1.2.7 固相萃取柱的選擇 采用固相萃取法進行凈化提取液，比較HLB、MCX、MAX 3種小柱對提取液的凈化效果，以各組分加標回收的峰面積為比較依據。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

由圖1可知，ZIC HILIC柱分離9種抗病毒藥物組分效果不理想，目標組分出峰重疊，分離度較差；而TSKgel Amide-80柱在乙腈—1%甲酸為流動相梯度洗脫模式下，可以實現部分抗病毒藥物組分的分離；在InertSustain Amide色譜柱上9種組分的保留效果較差，在前2 min內有6種待測組分基本分離出峰，而阿比多、阿昔洛韋、嗎啉胍由于極性較大，在此色譜柱上未保留，整體分離效果也較差；而Sielc Obelisc R色譜柱由于含極性基團和非極性混合基團，所以對9種組分的分離效果較好，出峰時間適宜，各組分也有較好的分離度，故選用Sielc Obelisc R色譜柱。

圖1 4種色譜柱的分離效果比較

2.2 質譜參數選擇

9種抗病毒藥物組分結構中均含有胺基基團，在離子化過程中易與H離子結合后帶有正電荷，所以采用正離子掃描模式對9種組分的混標溶液進行母離子和子離子的質譜掃描，并優化質譜參數，具體質譜分析參數見表2。

表2 9種組分的質譜參數?

2.3 流動相條件優化

甲醇—水、乙腈—水、乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.05%甲酸)、乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)和乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)等流動相在Sielc Obelisc R親水色譜柱上的總離子流圖見圖2。由圖2可知，流動相中含有一定比例的乙酸銨會維持流動相pH值的穩定性，能改善峰形，減少拖尾，洗脫效果最好；流動相中無甲酸存在的情況下，9種抗病毒藥物組分的電離效果不理想，出現峰型不對稱性等現象，將流動相中水更換為甲酸溶液后，流動相體系為酸性，待測組分電離更充分，分離情況得到改善。當流動相中含0.1%甲酸時，各組分的響應值最高，因此選擇以乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)為流動相，并以梯度洗脫模式，保證各組分有良好的峰形、分離度及較強的響應值。

1.奈韋拉平 2.泛昔洛韋 3.阿比多 4.阿昔洛韋 5.咪喹莫德 6.美金剛 7.金剛烷胺 8.奧司他韋 9.嗎啉胍

2.4 提取溶液的選擇

由圖3可知，1%乙酸—乙腈的提取效果整體優于其他3種提取溶液，能夠有效提取9種組分，且不同提取溶液間提取效果差異顯著(P<0.05)。這是因為在提取液偏酸且存在有機溶劑的溶液體系中，目標組分在提取液中的分配系數較高，樣品中的干擾物易除去，實現較好的提取效果。結合流動相中含有乙腈組分，為了減少溶劑間的轉化，因此選擇1%乙酸—乙腈溶液作為樣品的提取液。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 固相萃取柱的選擇

由圖4可知，HLB固相小柱的凈化效果最好，各組分的峰面積最高，與其他兩款固相小柱的效果差異顯著(P<0.05)。這是因為HLB固相小柱適用范圍廣，特異性不強，適合大多數化合物，而MCX和MAX固相小柱特異性強，對部分抗病毒藥物組分的保留性較差，因此選用HLB小柱進行凈化提取液較合適。試驗采用了新一代的PRiME HLB固相萃取柱，較傳統HLB固相小柱，免去活化和洗脫步驟，縮短了試驗時間，提高了效率，故選擇PRiME HLB固相小柱。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 方法的線性范圍與靈敏度

將9種抗病毒藥物組分的標準混合溶液以乙腈—10 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)為流動相進行梯度洗脫，繪制標準曲線，結果見表3，9種組分在0.1～50.0 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系良好，檢出限為0.1～0.5 μg/kg，定量限為0.3～1.5 μg/kg，方法靈敏度高。

表3 9種組分的線性關系及相關系數

2.7 方法回收率與精密度

分別添加低、中、高3個水平的9種抗病毒藥物標準品于樣品中進行加標回收試驗，結果見表4。

由表4可知，9種抗病毒藥物組分的加標回收率為82.3%～95.7%，RSD為3.2%～5.9%，說明試驗檢測數據的準確度和精密度可靠。

表4 回收率及相對標準偏差

2.8 實際樣品分析

對10份不同品牌動物源運動營養品中9種抗病毒藥物組分殘留進行分析發現，9種目標物組分含量均未檢出，結果良好，符合國家標準要求。為驗證方法的適用性和可靠性，對陰性樣品進行加標處理后(2.0，10.0，50.0 μg/kg)，分別用標準方法(SN/T 4253—2015)和試驗方法進行比較，結果見表5。由表5可知，試驗方法所測定的結果與標準方法均在合理的誤差范圍內，表明試驗方法適用于動物源運動營養品中9種抗病毒藥物組分殘留的測定。

表5 方法的適用性?

3 結論

建立了一種親水作用色譜—串聯質譜法檢測動物源運動營養品中9種抗病毒殘留的分析方法。結果表明，樣品經1%乙酸—乙腈溶液提取后，選擇PRiME HLB固相小柱凈化處理，可實現對動物源運動營養品中9種目標物組分的有效檢測，且與目前的標準方法相比，在保證準確性好、靈敏度高的同時，盡可能省去了復雜的前處理，降低了檢測成本，提高了檢測目標種類和效率。