食品中類固醇激素基體標準物質研究進展

吳利君 尹 營 戴麗雪 余麗波 李 存 彭 濤

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.山東國潤環境檢測有限公司，山東 泰安 271000)

類固醇激素(Steroid Hormones)，又稱為甾體激素[1]，可分為腎上腺皮質激素和性激素兩大類[2]，具有較強的生物活性和內分泌干擾效應[3]，可提高動物的繁殖生長效率，降低生產成本。違規使用類固醇激素會導致動物組織及產品相關激素殘留超標，人體食用后易引起不良反應甚至造成機體不可逆損傷，還會間接污染環境[4]。為有效避免食品安全風險，準確有效的檢測方法具有重要意義。基體標準物質可以反映藥物及其產物在動物機體內的代謝情況，模擬目標物與基質的實際結合狀態，減小基質效應的影響[5]，檢測過程中使用基體標準物質可有效提升檢測結果的準確性和真實性以及數據的可溯源性，同時還可使用基體標準物質對檢測人員能力、試劑和儀器、實驗室環境等影響因素進行評價，進一步提升檢測的可靠性,從多方面保障食品安全質量。

目前有較多科研計量機構對不同類別的基體標準物質進行了研制生產，歐盟已明確規定了在獸藥殘留分析中可使用基體標準物質。但由于中國的相關研究起步晚，較國外的研制水平和基體標準物質種類、數量等存在一定差距，固醇類激素基體標準物質數量更為稀少。研究擬對基體標準物質的分類、特性、研制流程以及應用進行總結，對目前中國已研制的食品中類固醇激素基體標準物質進行介紹，并分析中國基體標準物質研制發展中存在的問題和發展前景，旨在為中國激素類物質食品基體標準物質的研制提供依據。

1 基體標準物質概述

1.1 基體標準物質的定義及分類

根據JJF 1005—2005《標準物質常用術語和定義》，標準物質(Reference Material，RM)是一種已經確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值，用以校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的材料或物質。附有相關資質證書的標準物質為有證標準物質，中國有證標準物質可分為一級標準物質(GBW)、二級標準物質[GBW(E)][6]。基體標準物質(Matrix Reference Material，MRM)是具有實際樣品特性的標準物質，重現目標物與基質結合狀態，與預期測量樣品特性相同或相近，有效減小基質效應，從而對方法進行質量控制[7]。

根據制備工藝、適用范圍、原料等，食品基體標準物質可分為天然基體標準物質和添加基體標準物質。天然基體標準物質是在原料農產品種植或食源性動物飼養過程中依據藥物的使用周期或短期給藥，采集目標基質獲得陽性樣品，可以反映藥物違規使用后真實的代謝或殘留情況，但其制備周期長，成本較高；添加基體標準物質是通過在相應的陰性基質中添加一定濃度的目標物制成陽性樣品，模擬了相關食品成分、污染物、營養物質在食品中呈現的狀態，能滿足檢測、校正的基本要求，同時具有制備周期短、均勻性良好、目標物濃度易于控制等優勢[8-9]。

1.2 基體標準物質的特性

根據ISO Guide 35—2006，標準物質應具備均勻性、穩定性、溯源性3種特性。均勻性是指與物質有一種或多種特性相關的具有相同結構或組成的狀態[10]，通常分為瓶間均勻性和瓶內均勻性；穩定性是指標準物質在一段時間內特征參考量的變化情況，包括長期穩定性和短期穩定性，用于反映運輸和最大貯藏期的變化情況[11]；溯源性是指通過一條具有規定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結果或測量標準值能與國家測量標準或國際測量標準聯系起來的特性[12-13]。

1.3 基體標準物質的研制

基體標準物質由于需要考慮目標物、基體等多種影響因素，其研制過程主要包括依據目標物選擇原料基質、建立分析方法、基體標準物質的制備、均勻性評估、穩定性評估、定值、不確定度評估等，具體研制技術路線如圖1所示。

圖1 基體標準物質研制技術路線

1.3.1 基質的篩選 研制過程中，基體標準物質的基質選擇依據主要包括實際使用過程中的應用價值和目標物質。近年來，大多基體標準物質被應用于食品安全問題，因此主要以果蔬凍干粉以及動物源性食品作為基質；依據目標物質選擇基質時需考慮的因素相對復雜，不僅要考慮到目標物可能出現或污染的基質，還應考慮目標藥物是否在動植物體內存在分解代謝等情況，以獸藥基體標準物質為例，不易分解的藥物多污染動物肌肉和部分內臟組織，在動物體內代謝的藥物一般選取內臟和蛋、奶等產物為基質。

1.3.2 基體標準物質的制備 基體標準物質在制備過程中為保證特征值檢驗和定值的準確性，應充分考慮目標物質和基質的相關性質從而確定制備工藝和流程。由于大多基體標準物質均需要大量制備，原料數量相對較大，因此需要將多份陽性原料充分打碎、攪拌混合以保證制備過程中以及后期成品的均勻性。此外，為保證基體標準物質的穩定性，需要根據目標物質性質盡可能避免水分、光照等因素的影響，多數固態樣品采用冷凍干燥技術制成凍干粉并采用鋁箔袋充入惰性氣體或真空分裝，液態樣品則大多混勻后使用棕色西林瓶進行封裝。

1.3.3 均勻性檢驗 均勻性是標準物質的特征值之一，分為瓶間均勻性和瓶內均勻性。均勻性檢驗是對分裝后單瓶樣品內或不同樣品間進行檢測，通過測量結果是否在規定不確定范圍內判斷特性量值的均勻程度。隨機取樣的個數一般為10個或10個以上。均勻性研究的常用方式是單因素方差分析法，其他方法包括平均值的一致性檢驗法、極差法等[14]。影響均勻性的因素包括檢測方法的重復性和靈敏度、抽樣方法、測量順序等，但制備階段對均勻性起決定性作用，合適的原料、正確的制備工藝以及制備人員的能力可大大提高標準物質的均勻性。

1.3.4 穩定性檢驗 穩定性是指標準物質在規定的時間間隔和環境條件下，其特性量值保持在規定范圍內的能力[15]。通常用短期穩定性和長期穩定性對標準物質進行評定。短期穩定性是在指定的運輸條件下運輸期間標準物質特性的穩定性，受包裝條件、運輸方式以及溫度的影響；長期穩定性是在有證標準物質證書中所要求的特定貯藏條件下具有標準物質特性的穩定性，代表標準物質的有效期[16]。有證標準物質的短期穩定性檢測一般持續1～2個月，長期穩定性一般為24～36個月，選取5～6個時間點進行檢測[17]。物理因素、化學因素以及生物因素都會對標準物質的穩定性產生影響。標準物質的貯藏環境、運輸條件、包裝方式需根據不同藥品和基質的理化性質進行確定。標準物質在運輸貯藏過程中應處在避光、低溫、真空、惰性氣體等環境下以保持標準物質的特征值，提高標準物質的穩定性。

1.3.5 定值 根據JJF 1005—2005標準物質常用術語和定義，定值是對與標準物質預期用途有關的一個或多個物理、化學、生物學或工程技術等方面的特性值的測定。均勻性研究完成且均勻性符合要求后可進行定值，定值方法的確認要根據預期準確度以及不同方法的選擇性、檢出限、靈敏度等參數以及預期用途和方法成熟度等進行選擇，方法確認的實施環境應在定值的條件下進行[18]。

標準物質的定值方法包括：單一實驗室采用單一基準方法定值；單一實驗室采用兩種或多種不同原理的獨立參考方法定值；多家實驗室使用一種或多種以證明準確性的方法合作定值；利用特定方法定值；利用一級標準物質比較定值[19]。

1.3.6 不確定度評定 標準物質的不確定度又稱測量不確定度，用來表現測量結果的分散程度。在標準物質的研制測量過程中，不確定度由均勻性不確定度、穩定性不確定度、定值不確定度3部分組成[20]。定值時采用基準方法，當均勻性及穩定性檢驗測量方法與定值方法不一致時，分析引入均勻性和穩定性的不確定度十分重要。合成標準不確定度為定值不確定度、均勻性不確定度、穩定性不確定度平方和開方的疊加組成，合成標準不確定度乘以包含因子得出擴展不確定度也稱為總不確定度，該因子的數值需>1。定值不確定度由A類不確定度和B類不確定度構成，A類不確定度為規定測量條件下測得的量值按照統計分析的方法進行的不確定度分量的評定(包括重復性測量條件、期間精密度測量條件或復現性測量條件)；B類不確定度為權威機構發布的量值、標準物質的量值、校準證書、儀器漂移、測量儀器的準確度等級等。

1.4 基體標準物質的應用

中國的基體標準物質資源相對豐富，隨著近年來分析手段的不斷進步，人們逐漸提高了對基體標準物質的認知重視程度?；w標準物質的普遍應用包括保存和傳遞特性量值并建立測量溯源性[21]，標準物質作為測量標準，其特性值應能溯源到合適的單位或參考測量標準；保證測量結果的一致性和可比性[22]，通過檢測結果的反饋對相關實驗室儀器校準、性能、試驗操作人員、實驗室環境等進行能力評價；評估目標物的相關分析方法，在試驗條件相同的情況下判斷試驗方法的重復性、準確性、可再現性等，根據試驗結果優化試驗方法；保障和提高產品質量監督水平，切實發揮基體標準物質的在人們健康保障和社會經濟發展中的應用價值。中國現行基體標準物質共有13類[23]，自主研制及復制的基體標準物質已被應用至食品、化工、醫學、環境等多個領域。

醫學領域中，基體標準物質主要用于藥物含量、成分等質量控制[24]，建立完善的藥物溯源體系；金屬材料方面主要用于產品的化學成分及物理性能的分析；油品領域標準物質用于石油產品量值傳遞、方法評價和質量監督；食品基體標準物質數量相對較大，可用于評價并驗證食品安全及相關管理機制，對國內食品安全風險進行評估，在國際貿易中提供檢測報告和數據支撐；環境相關基體標準主要用于應對大氣污染、水污染和土壤污染，在環境安全監管中配合相關法律提供數據支持和相關量值。

2 食品中類固醇激素基體標準物質的研究現狀

類固醇激素主要分為腎上腺受體激素和性激素兩類，在實際使用中多作為飼料添加劑使用，藥用價值相對較低，適用范圍較小，同時由于部分類固醇激素被禁止使用，因此目前以類固醇激素為目標物的食品基體標準物質研制數量相對較少，主要為腎上腺皮質激素類的β-激動受體劑和部分類性激素或與性激素具有相似作用的物質，現行的有證基體標準物質共有6種且均為β-受體激動劑類，類固醇基體標準物質如表1所示。

表1 類固醇激素基體標準物質

2.1 β-受體激動劑基體標準物質

β-受體激動劑是一類化學合成的苯乙醇胺類物質[25]，屬于類固醇激素中腎上腺皮質激素的一種，俗稱瘦肉精。臨床上使用較多及可產生食物污染的藥物有萊克多巴胺(RAC)、鹽酸克倫特羅(CLB)、沙丁胺醇(SAL)、溴布特羅(BBT)、溴代克倫特羅(BCT)等[26]。β-受體激動劑添加進飼料被動物進食后在機體內代謝速率慢，殘留量較高[27]，消費者食用后會引起急性中毒以及不同程度的病變和危害[28]。目前，有關β-激動受體劑的檢測方法包括免疫分析法[29]、液相色譜法[30]、液相色譜串聯質譜法[31]、氣相色譜質譜聯用法[32]等，但其精確度和回收率等均存在一定的不足，而有關β-受體激動劑的基體標準物質數量相對較少，有證標準物質共有6種，其中一級標準物質4種，二級標準物質2種[23]。

李蘭英等[33]研制了豬尿凍干粉中鹽酸克倫特羅標準物質，建立了4種目標物濃度水平，采用液相色譜—串聯四極桿質譜聯用儀(LC-MS/MS)和酶聯免疫法對目標物進行檢測，均勻性和14 d內短期穩定性及12個月內長期穩定性良好，4個質量濃度的定值結果分別為0.65，1.28，3.78，11.50 ng/mL，標準不確定度分別為0.072，0.220，0.230，0.860 ng/mL，擴展不確定度分別為0.15，0.44，0.46，1.80 ng/mL，該標準物質的研制為中國滿足了豬尿中克倫特羅殘留實驗室質量控制和方法驗證提供了依據，同時也有利于實現肉類制品在屠宰前排除食品安全風險的條件；郭德華等[34]研制了魚粉中克倫特羅、沙丁醇胺基體標準物質，采用短期飼喂藥物的方式獲取陽性樣品，給藥期結束后采用凍干冷凍技術將魚肉制成粉狀樣品，采用液相色譜串聯質譜法對基體標準物質進行定值，均勻性、穩定性良好，克倫特羅及沙丁醇胺的定值結果分別為9.9，12.8 μg/kg，該標準物質采用鯽魚作為基質，條件控制和飼養簡單，大大降低了動物個體差異產生的影響，填補了水產品中β-受體激動劑基體標準物質的空白，后期檢測結果表明該標準物質可以滿足相關檢測機構、實驗室等對β-受體激動劑質量控制的要求。

2.2 雄激素基體標準物質

雄激素屬于類固醇激素中性激素的一種，主要由動物睪丸合成，腎上腺及卵巢也會少量產生。在動物養殖過程中，雄激素的使用對動物機體的影響是全身性的，可以促進肌肉合成，通過經典的基因途徑和非基因途徑來促進骨骼肌肥大[35]，縮短多種食用性動物的成熟時間和育肥期，大幅提高利潤轉化率。國內外學者報道的關于雄激素引發的食品安全問題的檢測方法研究相對較多，但檢測指標和檢測標準并未得到統一[36]，相關基體標準物質資源較為缺乏。

肖月婷等[37]建立了一種奶粉中類固醇激素基質標準物質同位素稀釋質譜定值方法，使用牛奶作為原料，添加睪酮和甲睪酮混合標準溶液后通過濕法噴霧技術制成粉狀物質，充分混勻后采用同位素稀釋質譜法(IDMS)對目標物質進行檢測并結合樣品稀釋法減小基質效應，回收率與精密度符合國標定值方法，均勻性及短期穩定性檢驗結果良好，通過不確定度評定后，睪酮和甲睪酮的量值分別為(19.4±1.4)μg/kg(k=2)，(21.0±1.4)μg/kg，該方法的建立填補了中國雄激素基體標準物質定值方法的空白，同時也為相關基體標準物質的研制、實驗室能力驗證及食品中雄激素殘留檢測提供了較為重要的參考意義。

2.3 雌激素基體標準物質

雌激素為另一類性激素，屬于強內分泌干擾物，對生物機體內分泌具有一定的破壞性。天然雌激素主要由哺乳動物卵巢合成，代表物質有雌酮、雌二醇等，人工合成雌激素藥物有炔雌醇、苯甲酸雌二醇等[38]。雌激素與其他大部分激素具有相同的促進動物生長、調節動物發情周期、提高繁殖效率等作用，常被作為飼料添加劑使用。由于穩定性較高，在動物體內不易被降解，人食用后會在體內積累，對生殖系統、生長發育甚至行為方面產生較為嚴重的影響[39]。除了直接污染動物性食品外，養殖過程中由于廢水及糞便處理不當導致環境中雌激素殘留的問題也屢見報道[40]。同時，產乳動物自身體內代謝的雌激素也存在殘留在食物及相關乳制品中的風險[41]，而長期食用被雌激素污染的乳及乳制品會一定程度增加患乳腺癌的風險[42-43]。李杰等[44]研制了動物性食品中雌激素類獸藥殘留檢測用同位素標記標準物質，選用玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮作為雌激素目標物，均勻性、穩定性良好，采用同位素稀釋內標法對標準物質進行檢測和定值，標準物質特征值為99.3～100.3 μg/mL，該標準物質通過多項考察可以滿足中國食品殘留檢測要求，具有一定的市場潛力；牛欣寧[45]研制了玉米粉中玉米赤霉烯酮ZEA基體標準物質，原料使用玉米顆?？瞻讟悠?，使用相應濃度的標準溶液浸泡24 h后通過冷凍干燥技術凍干，研磨成粉狀，充分混勻制成基體標準物質。ZEA基體標準物質使用高效液相色譜法檢測目標物質，采用鋁箔袋真空包裝，均勻性、14 d內44 ℃環境下短期穩定性以及12個月分別于4，-18 ℃下長期穩定性檢驗符合標準物質研制要求，通過多家實驗室對該玉米粉玉米赤霉烯酮標準物質聯合定值及不確定度評定后，結果為(137±26)μg/kg，該標準物質的研制豐富了中國類雌激素基體標準物質的種類，填補了中國農產品中雌激素污染基體標準物質的空白，為相關研究在后期研制、定值等提供了一定參考。

3 展望

固醇類激素基體標準物質研究的主要問題包括涉及基質數量少、目標物種類少以及特征值單一等。牛羊產品、禽蛋等在中國消費和進出口數量龐大，相關的固醇類激素基體標準物質尚處于空白；同時，類固醇激素的使用雖然已經受到嚴格限制，但相關藥物種類豐富，在食源性動物治療過程中使用廣泛，其可能導致的食品安全風險依舊存在；此外，目前已研制的基體標準物質多為單一特性值，無法完全滿足食品中類固醇激素的檢測需求。因此，推動固醇類激素基體標準物質的研制開發不僅可以有效提升國內的食品安全保障水平，面對不斷提升的國外食品安全標準也具有重要意義。

中國的基體標準物質種類和數量近年來雖處于上升階段，但多為復制產品，自主研發能力和國外相比依舊存在一定差距。為有效提升基體標準物質的研制水平和應用價值，加大宣傳力度，通過國內外技術交流、培訓等方式使人們熟知基體標準物質的作用，制定統一標準，使研制規范化，通過權威機構帶動具有研發能力的企業，對其進一步推廣，以擴大其應用范圍，從而使食品安全質控體系得到提升。