一株野生球蓋菇的鑒定及其菌絲生物學特性研究初報

張澤乾 劉 虹

（1山西農業大學，山西太原 030031；2山西農業大學山西功能食品研究院，山西太原 030031）

大球蓋菇Stropharia rugosoannulataFarl.ex Murrill隸屬于傘菌目Agaricales，球蓋菇科Strophariaceae，球蓋菇屬Stropharia，是一種著名的大型真菌[1]，也是聯合國糧農組織向發展中國家推薦栽培的食用菌之一，是一種重要的食、藥用真菌。該菌味美色優，營養豐富，具有增強人體免疫力、降低血糖等保健及藥用價值[2-6]。

我國野生球蓋菇資源比較匱乏，從已有發表的關于野生球蓋菇的報道來看，我國發現的野生球蓋菇主要特征為紅色、黃色或棕色，主要分布于我國臺灣、陜西、內蒙古、甘肅、四川、云南等省區[7-10]。

研究對象為采自山西省太原市婁煩縣云頂山的一株棕黃色野生大球蓋菇，該物種個體中到大型，肉質肥厚。為了開發利用該野生資源，筆者在形態特征鑒定的基礎上對其進行分子鑒定，并對該菌株進行生物學特性研究，以期為該野生菌株的馴化栽培、開發利用和后期規模化栽培提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）標本：野生球蓋菇菌株（SP1），2020年9月采自山西省婁煩縣云頂山海拔1 680 m（北緯37°52'43″，東經111°36' 06″）的櫟樹林草地，樣本新鮮且無病蟲害。組織分離法獲得純菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上純化后，篩選出菌絲生長旺盛的菌株作為母種，現保存于山西農業大學山西功能食品研究院，編號HSA361。

（2）母種培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉46 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL；pH自然。

（3）平板培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.03 g，硫酸鐵0.1 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 形態學鑒定

以體視顯微鏡和手持放大鏡觀察子實體宏觀特征，主要包括子實體、菌蓋和菌柄的形狀、顏色、表面有無鱗片以及菌褶的特征等；光學顯微鏡下觀察子實體顯微結構；以蒸餾水或3%KOH 制作水封片，用棉蘭和Melzer 試劑檢驗擔孢子壁是否喜藍以及淀粉質反應[11-13]。

1.2.2 分子鑒定

提取目標樣本（SP1）DNA，完成PCR 擴增，PCR擴增在FTGRAD2D 型PCR 擴增儀上進行，ITS 測序工作由北京中科希林生物技術有限責任公司完成。測序后ITS 基因序列通過BLAST 程序與GenBank 數據庫中所收錄的ITS 基因序列進行同源性比較核對，結合形態學特征對樣本進行鑒定[13-14]。

1.2.3 碳源試驗

以平板培養基為對照，分別以相當碳量的麥芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇代替其中的葡萄糖，培養基按配方制備好后于121.3 ℃，滅菌20 min 后備用。將SP1 供試菌株接種到裝有活化培養基（PDA）培養皿（直徑90 mm）中央，于25 ℃暗培養10～12 d，挑選長勢茁壯一致的菌落，在其邊緣用完全滅菌的打孔器（直徑6 mm）取生長一致的接種塊移至供試碳源培養基培養皿中心，置25 ℃暗培養10 d。按照十字交叉法每隔3 d 用游標卡尺測量菌落直徑，計算菌絲生長速度[15]，每個處理重復5 次。同時觀察菌絲長勢及菌落形態。

1.2.4 氮源試驗

以平板培養基為對照，分別以酵母膏、牛肉膏、麩皮、硫酸銨、尿素代替其中的蛋白胨。每個處理重復5次。將試驗菌株大小一致的菌種塊接種到上述供試培養基中央，置25 ℃暗培養10 d 后，并觀察菌絲長勢，測定菌絲生長速度。操作方法同碳源試驗。

1.2.5 碳氮比試驗

以平板培養基中的葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，碳氮總量23 g，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的碳氮比設置5 個處理，每個處理重復5 次。其他操作同碳源試驗。

1.2.6 培養溫度試驗

將試驗菌種接種在平板培養基中，培養溫度設15 ℃、18 ℃、21 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃6 個處理，每個處理重復5次。其他操作同碳源試驗。

1.2.7 培養基pH試驗

在超凈工作臺上用1.0 mol/L NaOH 溶液和1.0 mol/L HCl 溶液調整PDA 平板培養基酸堿度[16]，共設pH5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 七個處理，每個處理重復5次。其他操作同碳源試驗。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2003、SPSS、LSD 法進行數據處理和統計分析[17]。

2 結果與分析

2.1 形態學特征

標本擔子果中到大型（圖1）。菌蓋幼時半球形，成熟后漸平展，幼時直徑2.5～4.0 cm，成熟后5～12 cm，幼時灰褐色、褐色或黃褐色，成熟后變為淺黃色或黃褐色，表面有褐色鱗片，邊緣有內菌幕殘余。菌褶直生至彎生，灰紫色，漸變為褐色、灰褐色，較密，邊緣灰白色。菌肉白色，傷不變色，厚達2 cm。菌柄中生，長4～10 cm，粗1.2～2.0 cm，圓柱狀，或基部變粗成棒狀，白色，表面有片狀或棉絮狀鱗片，鱗片易脫落以至于成熟后近光滑，早期中實，后內部漸松軟，基部沒有菌索。菌環常缺，如有為膜質或絮狀，位于菌柄中上部。

圖1 喜楊球蓋菇Stropharia populicola生態照

擔孢子橢圓形，（5.5～7.5）μm×（3.5～4.5）μm，褐色，表面光滑，具有一個退化的芽孔。擔子柱棒狀，（25～30）μm×（10～12.5）μm，4 孢子型，小梗短于1.5μm。 緣 囊 體 大 量，（32.5～50）μm×（12.5～17.5）μm，棒狀至近梭形，頂部有或沒有短凸起，薄壁。子實層除擔子外有3 種成分，（1）黃囊體，棒狀或梨形，（27.5～32.5）μm×（7.5～12.5）μm，頂部有或沒有短指狀凸起，薄壁，內含黃色無定形物質；（2）側生薄壁囊狀體，罕見，大小為42.5μm×15.0μm，瓶形或近梭形；（3）棘狀類囊體（acanthocyte），具6～13條放射狀刺棘，長47.5μm，基部直徑5μm，厚壁。子實層菌髓組織菌絲平行排列，菌絲無色，直徑5～10μm。菌蓋皮層組織菌絲無色或淺黃色，薄壁，直徑5.0～7.5μm。菌蓋表面鱗片有成束菌絲聚集而成，菌絲直徑3.5～8.5μm，無色或淡黃色，薄壁。菌肉組織菌絲薄壁，無色，直徑5～15μm。菌柄皮層菌絲平行排列，菌絲無色，薄壁，直徑5～15μm。鎖狀聯合罕見[18]。

2.2 分子比對結果

提取的SP1 菌株ITS 和nrLSU 片段在GenBank上比對結果（表1），來自中國山西省云頂山地區的野生球蓋菇HSA361 經樣本分子比對，結合形態學鑒定可以確定研究物種是喜楊球蓋菇Stropharia populicola[18]。

表1 球蓋菇（SP 1）樣本及其GenBank比對結果

2.3 供試碳源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

碳源是食藥用菌生長所必不可少的營養物質[19]。由表2可以看出，供試碳源培養基對球蓋菇（SP1）菌絲的生長勢和生長速度會產生很大的影響。以葡萄糖為碳源的培養基上菌落呈圓形而完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強，平均生長速度最快，為2.81 mm/d，顯著快于其他碳源；碳源為甘露醇或麥芽糖表現次之，果糖表現最差，菌絲乳白色、稀疏，生長勢弱，平均生長速度最慢，為1.76 mm/d。

表2 供試碳源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.4 供試氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

氮源是食用菌生長的第二大營養[20]。不同的氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長勢、平均生長速度影響顯著（表3）。在以酵母膏為氮源的培養基上，球蓋菇（SP1）的菌絲潔白，菌落形態橢圓形、完整、濃密、生長勢最強，平均生長速度最快，為2.42 mm/d，對比其他氮源處理差異顯著；氮源為蛋白胨、硫酸銨表現次之；尿素表現最差，菌絲僅在接種塊周圍生長甚至不生長。

表3 供試氮源對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.5 試驗培養基碳氮比對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由表4可以看出，球蓋菇（SP1）菌絲在碳氮比為5∶1～25∶1 的培養基上均可生長，生長勢和平均長速呈顯著差異。在碳氮比為10∶1 的培養基上菌絲生長勢最強，平均長速最快，為2.71 mm/d，與碳氮比5∶1、15∶1、20∶1、25∶1 差異顯著；其次為碳氮比5∶1和15∶1，二者差異不顯著，但與其他碳氮比菌絲生長速度差異顯著；表現最差的為碳氮比25∶1，菌絲稀疏，生長勢弱，生長速度最慢。

表4 試驗培養基碳氮比對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.6 培養溫度對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由表5 可以看出，球蓋菇（SP1）的菌絲在15～30 ℃培養均可生長，生長勢和平均長速差異顯著。菌絲生長最適宜的溫度為25 ℃、21 ℃，生長勢最強、平均長速最快，分別為2.58 mm/d和2.55 mm/d，與其他處理差異顯著；當培養溫度低于25 ℃時，菌絲平均長速隨溫度的升高呈逐漸加快的趨勢，且生長勢趨強；當培養溫度高于25 ℃時，菌絲平均長速隨溫度的升高呈逐漸下降的趨勢，且生長勢趨弱。

表5 培養溫度對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

2.7 培養基pH對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

由 表6 可 以看出，培 養基pH 5.0～8.0 球 蓋菇（SP1）菌絲均可生長，且隨著pH 的升高，菌絲平均長速呈現先升高后下降的趨勢，以培養基pH 7.0、pH7.5 菌絲生長表現最好：菌絲生長勢最強，平均長速最快，分別為2.69 mm/d、2.55 mm/d，菌落形態為橢圓形，形態完整，濃密，與其他pH 處理菌絲生長差異顯著；pH6.0 及以下或pH 8.0 時，菌絲生長勢弱，菌絲平均長速顯著下降。

表6 培養基pH對球蓋菇（SP1）菌絲生長的影響

3 小結

經形態學和DNA 序列比對，確認采自山西省云頂山地區的野生球蓋菇是喜楊球蓋菇Stropharia populicola。

菌絲培養特性研究結果，喜楊球蓋菇菌絲生物學因子與陳永剛等[21-22]研究大球蓋菇的結果相似，表明喜楊球蓋菇菌絲生長所需主要營養物質與大球蓋菇相似。