NaAsO2通過Hippo通路影響PC12細胞形態和突觸蛋白

劉 宇，李 成，朱 衛，吳 松，劉曉紅，王宏健，王東艷，楊 莉，潘際剛

(貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種自然環境中廣泛存在的非金屬元素[1]。人類在自然環境和工業活動中長期接觸受砷污染的水、空氣和食物而中毒，造成組織器官損傷、甚至癌變。此外，砷引起神經系統損害也受到人們越來越多的關注[2]。但目前砷引起神經損傷的具體機制仍不是十分明確。Hippo信號通路是一條在進化上高度保守的激酶級聯信號通路，主要控制器官大小、組織穩態和組織再生[3]。本課題組已經證實，NaAsO2可通過激活Hippo信號通路，誘導PC12細胞凋亡。突觸后致密蛋白95(post synaptic density protein，PSD95)、突觸素蛋白(synaptophysin，SYN)作為神經突觸功能相關蛋白，其表達和缺失在神經系統疾病中十分重要[4]。因此，本實驗在前期研究的基礎上探討Hippo通路是否參與NaAsO2對PC12細胞活性、形態以及PSD95、SYN神經突觸相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 PC12細胞株(中科院昆明細胞庫)

1.1.2試劑 亞砷酸鈉(Sigma)，DMEM培養基、青霉素/鏈霉素(Gibco)，胎牛血清(BI)，CCK-8(碧云天)，PSD95、SYN(武漢三鷹)，XMU-MP-1(MCE)、抗兔IgG-HRP二抗(中杉金橋)，ECL曝光液(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 PC12細胞的培養使用DMEM全培養基，培養在5% CO2、37 ℃環境的培養箱中。

1.2.2細胞處理及分組 細胞毒性實驗分別用0、10、20、30、40、50、60 μmol·L-1NaAsO2處理24和48 h，篩選NaAsO2濃度后分為Control組、XMU-MP-1組、NaAsO2組、XMU-MP-1+NaAsO2組。

1.2.3CCK-8法檢測細胞存活率 CCK-8檢測不同濃度NaAsO2處理24和48 h、XMU-MP-1處理和XMU-MP-1+NaAsO2處理后的細胞存活率。

1.2.4倒置顯微鏡觀察細胞形態、檢測細胞數量、細胞平均長度 利用ImageJ軟件計數。對40 μmol·L-1NaAsO2、XMU-MP-1和XMU-MP-1+NaAsO2處理24 h的細胞隨機選取50個細胞進行長度測定。

1.2.5Western blot檢測PSD95、SYN蛋白表達 提取各組蛋白并用BCA法定量。經電泳，轉膜，封閉后，孵育一抗、二抗，經ECL曝光。

2 結果

2.1 NaAsO2對PC12細胞活力的影響CCK-8檢測表明，與對照組相比，不同濃度NaAsO2處理24或48 h均使PC12細胞活力降低(P<0.05)。

2.2 Hippo通路參與NaAsO2對PC12細胞活力的影響與對照組相比，NaAsO2(40 μmol·L-1)組細胞活力降低(P<0.01)；XMU-MP-1組細胞活力無影響；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組細胞活力明顯增加(P<0.01)。

2.3 Hippo通路參與NaAsO2對PC12細胞形態的影響與對照組相比，NaAsO2組細胞形態由長梭形變為橢圓形；XMU-MP-1組細胞形態無影響；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組細胞總數量和平均長度均增加(P<0.05)。

2.4 Hippo通路參與NaAsO2對SYN、PSD95突觸相關蛋白表達水平的影響與對照組相比，NaAsO2組SYN、PSD95蛋白表達明顯降低(P<0.05)；MU-MP-1組SYN、PSD95蛋白表達無影響(P>0.05)；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組SYN、PSD95蛋白表達明顯增加(P<0.01)。

3 討論

砷可通過抑制神經前體細胞的增殖、成熟和神經元遷移導致中樞和周圍神經系統損傷[5]。本實驗染砷組細胞數量變少、細胞間距變大、形態由長梭形變為圓形或橢圓形。CCK-8實驗也顯示砷處理的活細胞數量呈時間、劑量依賴性下降。

突觸形成是突觸可塑性的一個重要指標，突觸丟失可導致認知缺陷[6]。SYN和PSD95作為突觸相關蛋白，在維持突觸的正常功能和突觸可塑性中起著重要作用。研究發現，在患有阿爾茨海默病大鼠腦組織中，PSD95、SYN蛋白的表達下調[7]，本實驗中，NaAsO2導致PC12細胞中PSD95、SYN蛋白的表達降低，伴隨神經突起縮短，形態呈圓形或者扁圓形改變。提示，NaAsO2影響突觸蛋白PSD95、SYN的表達，損傷神經突起，細胞活性降低，影響神經生長發育。

Hippo通路抑制劑XMU-MP -1抑制MST1/2活性從而抑制下游蛋白LATS1的磷酸化。在本實驗中，XMU-MP -1預處理可以逆轉NaAsO2誘導的PSD95、SYN蛋白水平的下調、細胞長度、活力降低，提示Hippo通路參與NaAsO2對PC12細胞活力、形態和突觸蛋白的影響。然而，NaAsO2是如何通過Hippo通路下調突觸蛋白PSD95、SYN的表達從而造成PC12細胞損傷的，仍需進一步的探討。